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一种优化的DNA家族改组方法
目的:优化DNA家族改组方法,增加改组分子库的多样性.方法:以人、猴、兔的BPI23基因为模板,首先将3种基因的PCR产物等量混合后用DNaseⅠ消化,回收50bp左右的片段,再经过无引物和有引物两步PCR反应获得与原基因大小相同的改组分子,将其与载体连接获得改组分子库.随机挑取4个克隆测序观察改组效果.结果:4个克隆均为3种模板基因片段的杂合体,其中3个克隆还包含氨基酸点突变,表明改组分子库多样性较大,改组方法较为成功.结论:该方法的建立为进一步筛选高活性的BPI23分子打下基础,并为改组其他基因家族提供了借鉴.
关键词： DNA改组 体外进化 杀菌/通透性增加蛋白 -
评人类的新进化
进化本是生物学领城的专有名词,但现在出现了一些误解,如把进化等同于进步、等同于科学、当成时髦等.新进化论是人类学理论的一个学派,与国内某些研究生教材所提的人类新进化不是一回事.就人类的新进化而论,"体外进化"和"体内进化"的说法都是不能成立的,它较之传统生物学意义上的进化特点也是子虚乌有的.尽管人类新进化的思想苗头尚未蔓延开来,但它将产生严重的负面影响和后续不良反应:一是促进自我现念膨胀,二是助长生态环境恶化,三是导致进化研究混乱.
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基于易错PCR的菌丝霉素的定向进化
以菌丝霉素成熟肽经大肠杆菌密码子优化后的基因为基础,采用易错PCR技术,使用低保真的Taq酶,调整Mg2+浓度、添加Mn2+,改变PCR扩增程序,获得易错PCR产物.经克隆、转化后,挑取200株突变体进行测序鉴定,并进行抑菌活性筛选,筛得突变体M-1.基因比对结果显示,突变体M-1中有1个碱基发生突变,使得31位氨基酸由丙氨酸(Ala)变成精氨酸(Arg).蛋白质分子空间结构模拟显示,突变位点位于蛋白质的β折叠上,靠近活性中心,氨基酸残基由疏水性变成极性,推测更有利于与lipid Ⅱ的特异性结合,增强抑菌活性.本研究还对突变体小肽M-1进行了分离纯化.抑菌活性试验表明,突变体小肽M-1的抑菌活性是菌丝霉素的2倍.
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基于易错PCR的头孢菌素C酰化酶的定向进化
以前期工作中获得的一个可以直接转化头孢菌素C (CPC)为7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的CPC酰化酶为基础,采用易错PCR,引入不同浓度的Mg2+和Mn2+,所得易错PCR产物经克隆、转化后进行初筛,共筛选了400株转化子,其中有35株酶活力得到提高.采用金属螯合亲和色谱法分离得到纯酶后再进行复筛,其中一株酶活力显著提高,转化率提高约35％.测序结果显示,该CPC酰化酶突变蛋白的编码序列中有两个碱基发生突变,使得第122位的丙氨酸被替换为缬氨酸.在适条件下,该酶催化CPC生成7-ACA的转化率为95％.
