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睫状神经营养因子工程菌产物纯化工艺的建立
人睫状神经营养因子(CNTF)是具有促进神经元存活、防止神经损伤等功能的细胞因子.它在神经系统的发育、分化和损伤后修复过程中起重要作用,因而具有广泛的临床应用前景.由于天然CNTF的来源少,提取难,因而CNTF基因工程的研究受到广泛重视且进展很快.目前研究重点主要有生物活性的重组蛋白获得和突变体生物功能的探讨两个方面.本研究得到了具有一定纯度的人CNTF,为深入了解CNTF结构与功能的关系以及基因工程药物开发研究奠定了基础.
关键词： 神经生长因子 基因表达 蛋白质类/分离和提纯 -
RS21-C6分子的原核表达、纯化、抗体制备及免疫组织化学分析
目的:在原核细胞中表达胸腺发育相关分子RS21-C6重组蛋白,制备RS21-C6的多克隆抗体,研究RS21-C6分子在胸腺组织中的分布.方法: 在大肠杆菌中表达和纯化RS21-C6重组蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体,以免疫组织化学实验分析RS21-C6分子在小鼠胸腺的分布.结果: 成功表达和纯化了RS21-C6重组蛋白,并制备获得高效价的特异性多克隆抗体.免疫组织化学显示RS21-C6分子在胸腺髓质区有较强的表达,在皮髓质交界处和皮质区也有散在分布.从胸腺细胞分布类型来看,RS21-C6分子共表达于胸腺淋巴细胞和基质细胞.结论: RS21-C6分子在胸腺分布广泛,且具有较高的表达水平,推测其在胸腺细胞发育的不同阶段均可发挥作用,是一个可能具有多种功能的胸腺发育相关分子.
关键词： RS21-C6 胸腺 基因表达 蛋白质类/分离和提纯 免疫组织化学 -
高迁移率蛋白B1免疫调控机制研究
目的 初步探讨高迁移率蛋白(HMG)B1与活化T细胞核因子(NFAT)2的结合区域.方法 首先构建HMGB1真核表达质粒,然后确定HMGB1分段位置,分别构建HMGB1的A box区域与B box区域真核表达质粒,以及NFAT2的真核表达质粒.通过蛋白纯化及体外翻译技术得到纯化蛋白,后进行GST沉降实验,观察HMGB1区域蛋白与NFAT2蛋白的结合情况.结果 在谷胱甘肽转移酶-沉降实验中,可检测到HMGB1 B box融合蛋白与NFAT2结合的阳性条带,不能检测到HMGB1 A box融合蛋白与NFAT2结合的阳性条带.结论 HMGB1可通过B段区域与NFAT2发生相互作用.
关键词： 高迁移率族蛋白质类/免疫学 转录因子 遗传载体 质粒 蛋白质类/分离和提纯 -
大肠杆菌表达的重组人BMP-2和hBMP-4成熟肽大规模制备方法的比较
目的:大规模制备人骨形成蛋白成熟肽(hBMP-m):hBMP-4m和hBMP-2m.方法:两种工程菌株分别含有能够高表达hBMP-4m和hBMP-2m的质粒,分别导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵和诱导表达,离心收集菌体,悬浮所收集的菌体,裂菌,洗涤4次.预先取少量样品进行探索实验后,全部包涵体分别用8 mol/L尿素缓冲液溶解,上Sepharose SP-FF阳离子柱.结果:发酵菌液A600 nm值分别为28.8和26.3.SOS-PAGE电泳后吸光度扫描表明hBMP-4m占细菌总蛋白量的40.0%,hBMP-2m占细菌总蛋白量的47.2%.洗涤4次后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的82.9%,hBMP-2m占蛋白量的84.5%.上Sepharose SP-FF阳离子柱后,分别收集0.35 mol/L NaCl和0.20 mol/L NaCl洗脱部分,获得纯度为96%的hBMP-4m及纯度为95%的hBMP-2m.其收获量分别为1.30 g/L发酵液和1.25 g/L发酵液;收得率分别为34.33%和34.81%.结论:大规模制备hBMP-4m和hBMP-2m时,使用相同的发酵程序及相近的纯化方法,都能够得到较好的收得率、较高的收获量和纯度.
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小鼠ERA蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化
目的:对小鼠ERA蛋白(mERA)进行表达、纯化,为真核生物ERA功能研究奠定基础.方法:构建MBP-mERA融合表达载体.在大肠杆菌中诱导表达融合的小鼠ERA蛋白,经直链淀粉亲和层析纯化,Western Blotting鉴定所表达纯化的蛋白.结果:表达的MBP-mERA融合蛋白占菌体总蛋白的18 %;纯化后的融合蛋白纯度为70 %;Western Blotting证实了mERA蛋白的表达.结论:利用基因重组技术,在大肠杆菌中高表达了mera基因,并对融合蛋白进行了初步纯化.
关键词： 小鼠 era基因 基因表达 蛋白质类/分离和提纯 -
RBX诱骨活性成分的分离与纯化
目的重组合异种骨（RBX）作为一种新型植骨材料在临床治疗骨缺损、骨不连等病例中取得了显著疗效. 需进一步研究重组合异种骨中诱骨活性蛋白的相对分子质量范围. 方法采用肝素亲和层析技术纯化RBX中诱骨活性蛋白即骨形态发生蛋白(BMP)，利用小鼠肌袋实验检测其骨诱导活性，再用聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）测量RBX中诱骨活性蛋白纯化后的相对分子质量. 结果在纯化近20倍后，获得8.23 mg高度纯化的蛋白质，组织学观察其活性发现植入小鼠股部第10日，有大量软骨细胞及软骨岛的出现，在局部区域还可见到条索状骨小梁出现，SDS-PAGE电泳发现这种蛋白质的相对分子质量为35×103，经还原后单体的相对分子质量为22×103. 结论重组合异种骨（RBX）中35×103的蛋白质经还原后为22×103，其单独使用具有异位成骨活性，为RBX的临床应用提供了理论依据.
关键词： 骨折愈合 蛋白质类/分离和提纯 -
1PEP-1-p27mt融合蛋白的原核表达及纯化
目的:构建融合蛋白PEP-1-p27mt的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化.方法: 通过PCR 方法自pORF9-hp27mt v21质粒中扩增p27mt基因,克隆入中间载体pGEM-T Easy Vector.经Xho I和BamH1双酶切后,构建原核表达载体pET15b-pep-1-p27mt,经测序证实构建成功后转化E coli BL21(DE3)pLys S,表达PEP-1-p27mt融合蛋白,经Ni-NTA 树脂亲合层析,纯化产物进行SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定.结果: 成功构建PEP-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了相对分子量为32×103的PEP-1-p27mt融合蛋白.结论: PEP-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建及目的蛋白的表达纯化,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的研究提供了理论基础.
关键词： 蛋白质类/分离和提纯
