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阴沟肠杆菌Amp C酶的分离纯化
目的 分离纯化Amp C酶并对酶的理化特性进行相关研究.方法 用超声破碎法裂解细菌,用离子层析等技术对酶进行分离纯化,用电泳等技术进行理化特性的研究.结果 获得了纯品酶,并通过其理化特性证实为Amp C酶.结论 本实验所采用的分离纯化技术能有效地获得纯品Amp C酶.
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Amp C酶检测方法的探讨
目的 建立简便检测肠杆菌科细菌中Amp C酶的方法.方法 分别采用双纸片确证法和多剂量协同法检测35株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌,并用三维试验和Amp C酶酶量直接测定法进行对比,同时检测这些菌产ESBL的情况.结果 双纸片确证法检测出12株Amp C酶,不受ESBL的干扰,与直接酶量检测法完全一致,敏感性高于三维试验,多剂量协同法敏感性较差.结论 双纸片确证法可作为临床检测Amp C酶的方法.
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肠杆菌科细菌去阻遏持续高产AmpC酶的检测与ampD基因突变的研究
目的了解amp D基因突变与持续高产 Amp C酶的关系.方法对53株细菌用三维试验方法检测Amp C酶,进行等电点测定和amp D基因扩增,2株测定核苷酸序列.结果 32株阴沟肠杆菌中9株检出Amp C酶,检出率为28%,12株枸橼酸杆菌有3株检出,检出率为25%.其余细菌没有检出.能被邻氯西林抑制的条带主要有7.96、8.7、8.8和8.9.有2株三维试验阳性而amp D基因扩增阴性.对2株亚胺培南中介其余抗生素耐药的细菌amp D基因测序,结果突变主要发生在表型的C′-末端.阴沟肠杆菌主要在101、149、155、166位氨基酸发生改变,枸橼酸杆菌主要在95、158、164位氨基酸发生改变.结论 amp D基因突变可导致AmpC酶C′-端氨基酸改变,从而使Amp C酶去阻遏持续高产,并导致细菌对β-内酰胺类抗生素耐药.因此有必要在临床常规检验中推广三维试验方法检测Amp C酶.
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阴沟肠杆菌Amp C酶的特性研究
本文对阴沟肠杆菌Amp C酶进行了以下5个方面研究,其内容和结果分别为:(1)联合药敏实验:用平皿二倍稀释法研究第四代头孢菌素头孢吡肟,第三代头孢菌素头孢他啶、头孢噻肟、头孢呋辛与β-内酰胺酶抑制剂舒巴坦联合对34株头孢他啶耐药菌,6株头孢他啶中敏菌及15株头孢他啶敏感菌的体外抗菌活性.结果表明舒巴坦使头孢他啶对32.7%(18/55)的阴沟肠杆菌的抗菌作用有明显抗菌增效作用.96.4%(53/55)的阴沟肠杆菌对第四代头孢菌素头孢吡肟敏感.(2)酶稳定性实验:紫外测定法测定4株标准菌和6株临床分离菌产生的Amp C酶对β-内酰胺类抗生素的水解率,结果表明阴沟肠杆菌产生的β-内酰胺酶对第一代头孢菌素头孢唑林、头孢氨苄,第二代头孢菌素头孢克洛,第三代头孢菌素头孢哌酮及青霉素、氨苄西林、哌拉西林的水解率高.对第二代头孢菌素头孢呋辛、第三代头孢菌素头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶,第四代头孢菌素头孢吡肟以及亚胺培南、美洛培南和单环类β-内酰胺抗生素氨曲南的水解率较低.β-内酰胺酶抑制剂舒巴坦对4株标准产酶菌及6株临床分离菌产生的β-内酰胺酶均无抑制作用,而三唑巴坦则对上述酶有明显的抑制作用.(3)Amp C酶分子量测定:用SDS-PAGE测定酶的分子量,结果表明Amp C酶的分子量约为39.6kD.(4)Amp C酶等电点测定:用等电聚焦仪测定Amp C酶的等电点,结果表明EB131和E265A标准菌产生的酶的等电点约为8.65.4株临床分离菌所产生的酶的等电点在8.65～9.30之间.(5)amp C基因扩增:用PCR对55株阴沟肠杆菌进行amp C结构基因的PCR扩增,结果表明有51株PCR扩增阳性.
