首页 > 文献资料
-
放线菌野生株代谢功能的核糖体工程改造与新产抗肿瘤活性产物研究
目的利用核糖体工程技术,改造放线菌次级代谢功能,筛选获得抗肿瘤活性突变株,并对突变株新产活性产物进行研究.方法 以海洋来源无活性放线菌野生株HLF-39和HLF-43为出发菌,通过单菌落挑选与平板划线培养,分离纯化链霉素抗性突变株,通过摇床液态发酵和发酵提取物乙酸乙酯萃取样品的抗肿瘤活性筛选,获得抗肿瘤活性突变株;采用活性跟踪与微量预试先导-放大实验制备组合的实验模式,与原始菌样品对照比较,在快速确定差异活性斑点基础上,组合各种色谱技术,分离纯化突变株新产抗肿瘤活性产物;根据理化性质和波谱数据鉴定化合物结构;采用MTT法测评抗肿瘤活性.结果 链霉素对HLF-39和HLF-43的低抑菌浓度分别为3和10 mg·L-1.经抗性筛选,得到对链霉素产生抗性的HLF-39突变株28株、HLF-43突变株204株.在所得突变株中,3株HLF-39突变株和14株HLF-43突变株有抗肿瘤活性,100 mg·L-1样品对K562细胞的抑制率大于20%;其中,4株分别对11、100、200和300 mg·L-1链霉素产生抗性的HLF-43突变株CHS-21101、CHS-210010、CHS-220002和CHS-230001活性显著,100 mg·L-1样品对K562细胞的抑制率分别达59 5%、50 0%、44 1%和59 6%.从CHS-21101发酵物中分离得到2个该突变株新产抗肿瘤活性产物,并分别鉴定为环(4-羟脯-亮)二肽(1)和phencomycin(2).化合物1和2对K562细胞呈抑制活性,100 mg·L-1抑制率分别为33 9%和21 4%.结论 利用核糖体工程抗性筛选技术,从2株无活性放线菌野生菌株成功筛选得到17株具有抗肿瘤活性的链霉素抗性突变株,从其中1株发酵物中分离鉴定了2个该突变株新产抗肿瘤活性产物.用核糖体工程技术改造无活性放线菌野生株的次级代谢功能,可筛选获得活性突变株并提供深入研究新产活性产物,从中筛选新药及其先导结构,从而拓展药源放线菌活性菌株新资源.
-
拓展微生物药源活性新菌株资源的新方法探索
在药源微生物活性产物研究中,分离得到的绝大多数菌株往往因无活性而被大量闲置或被选择销毁,造成前期投入的极大浪费和菌株资源开发利用效率严重低下.因此,如何将大量无活性菌株有效转化成活性菌株从而拓展药源微生物资源已成为重要研究课题.本课题组近几年一直在探索开展海洋来源无活性野生菌株的活性化转化与新产活性产物研究,并在无活性放线菌和真菌相关研究中取得了较好进展.本文简要归纳介绍包括尚未详细报道的新近进展在内的部分研究结果.
-
微生物核糖体工程在抗生素研发中的应用
为有助于解决全球多重耐药菌感染问题，有必要加速抗生素的研发。针对微生物拥有的巨大生物合成潜力的核糖体工程（ribosome engineering），利用链霉素、庆大霉素和利福霉素等与微生物核糖体或 RNA 聚合酶的相互作用，有助于快速、简便地筛选出对应的突变菌株，进而改进其环境耐受性，提高其次级代谢产物的产量或产生新的天然产物。本文主要综述核糖体工程在抗生素产量提升，以及新抗生素发现等方面的研究进展。
-
核糖体工程技术选育米尔贝霉素高产菌株
本实验室中保存的一株从土壤中分离得到的米尔贝链霉菌(Streptomyces milbemycinicus)27号菌株所产米尔贝霉素A3和A4的初始产量分别为61.0和23.8μg/mL.以该菌株为出发菌株,采用核糖体工程技术,结合紫外诱变技术,对米尔贝霉素产生菌米尔贝链霉菌进行诱变,并以链霉素耐受为筛选压力进行筛选.经过诱变后对单菌落进行摇瓶复筛,其中正突变株中米尔贝霉素产量高的菌株编号是R2-6-5,其米尔贝霉素A3和A4的产量分别是105.2和38.8μg/mL,较原始菌株分别提高了72.5％和63.3％,且遗传稳定.后,对产量变化较大的11株突变株基因组中rsmG基因和rspL基因进行突变位点分析,发现在rspL基因内均未发生突变,rsmG基因均发生突变.本研究表明,链霉素抗性降低的突变菌株确实都在相关基因内发生突变,且核糖体工程结合紫外诱变的诱变方式效果良好,能够快速有效的提高米尔贝链霉菌生物合成米尔贝霉素的能力.
-
盐霉素高产菌株的筛选研究
目的 优化高通量筛选盐霉素高产菌株流程,高通量筛选出具有遗传稳定性的产盐霉素高产菌株.方法 以核糖体工程理论为基础,常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)及高通量筛选技术(high-throughputscreening, HTS)对产盐霉素的白色链霉菌(Streptomyces albus)S12诱变筛选,并以琼脂块扩散法为基础建立一种快速检测盐霉素的方法应用于高通量筛选过程初筛.结果 获得具有氯霉素和四环素双重抗性的高产菌株Tet30Ch125.摇瓶发酵实验结果表明:突变株Tet30Ch125盐霉素效价由初始菌株的16306U/mL提高到34712U/mL,提高了112％,且遗传稳定性良好.同时建立一种快速检测盐霉素的方法——琼脂块扩散法并应用于高通量筛选过程初筛中,缩短筛选周期12d,优化了筛选流程.结论 首次综合运用核糖体工程推理选育技术、常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)及高通量筛选技术(high-throughput screening,HTS)对产盐霉素的白色链霉菌(S.albus)诱变筛选,是很好的菌种选育策略,适合工业菌种的选育.
