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成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察
为探索稳定的成年大鼠心肌细胞的分离和培养方法,应用生物酶(5 g/L胰蛋白酶及1 g/L胶原酶)灌注法分离成年大鼠心肌细胞,用形态学及台盼蓝染色法鉴定分离的心肌细胞,并在光镜和电镜下观察和摄像记录.结果:心肌细胞的存活率为91.7%;存活的心肌细胞静止地贴在培养板底上,细胞完整,呈杆状,长宽比约为4～6∶1.结果提示:该方法是比较理想的心肌细胞培养法.
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多用途成年大鼠心室肌细胞分离方法
目的 建立稳定的可同时用于细胞培养和膜片钳实验的成年大鼠心室肌细胞的分离方法 .方法 应用Langendorff灌流.生物酶消化法分离耐钙心肌细胞.分别用左右心室肌做细胞培养和全细胞膜片钳研究.结果 左室心肌细胞数(3.7±0.6)× 10~6,杆状细胞得率(84.85±2.7)%.右室心肌细胞横纹清晰,折光率好,膜片钳实验时容易封接破膜,记录到典型的I_(Ca).L、I_(K1)、I_(to)、I_(Na)电流.结论 该方法 简单、节约、重复性好,改善了杆状细胞得率、细胞质量,左右心室肌细胞分别能很好地用于细胞培养和膜片钳实验.
关键词： 成年大鼠心肌细胞 细胞培养 膜片钳 Laugendorff灌流 -
MCSCs-exosomes对成年大鼠心肌细胞缺氧损伤的干预作用
目的 探讨来源于骨髓源性心肌干细胞的外切体(MCSCs-exosomes)对成年大鼠心肌细胞体外缺氧损伤诱导凋亡的干预作用.方法 将体外培养的成年大鼠心肌细胞随机分为对照组、缺氧组和MCSCs-exosomes预处理组.随后进行形态学观察、细胞计数,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2,bax)的表达变化,流式细胞仪检测凋亡率的变化.结果 与对照组相比,缺氧组细胞凋亡相关指标均明显升高,细胞计数下降(P＜0.01),Bcl-2/bax表达下调(P＜0.01),凋亡细胞比例明显增多.而MCSCs-exosomes预处理组可明显改善缺血缺氧损伤时的细胞活力,上调Bcl-2/bax的表达,降低凋亡细胞的比例(P均＜ 0.05).结论 MCSCs-exosomes预处理可以明显改善体外培养缺氧损伤诱导的成年大鼠心肌细胞的凋亡情况,其机制可能是通过抗凋亡途径减轻缺氧时细胞的损伤.
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成年大鼠心室肌细胞的分离、培养与鉴定
目的探讨成年大鼠心肌细胞的分离、培养方法.方法麻醉后取成年Wistar大鼠心脏连接于Langendorff装置上进行0.1%胶原酶+0.1%透明质酸酶灌注肖化分离心肌细胞,纯化后培养于DMEM培养基.用免疫荧光染色方法鉴定心肌细胞,并在倒置显微镜、电镜下观察细胞的形态结构.结果本方法分离、培养的心肌细胞纯度为98%,细胞活性为92%,杆状细胞率为82%.结论该方法简单有效,为深入研究成年心肌细胞打下了基础.
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siRNA沉默PPARγ基因对大鼠心肌细胞缺血再灌注致胰岛素抵抗现象的影响
目的 观察小于扰RNA(siRNA)沉默过氧化物酶体增殖物激活受体基因(PPARγ)的表达对成年大鼠缺血再灌注损伤(IRI)心肌细胞胰岛素抵抗的影响.方法 培养成年大鼠心肌细胞,构建沉默大鼠心肌细胞PPARγ基因特异siRNA,以脂质体介导转染离体培养的大鼠心肌细胞.制备心肌细胞IRI模型.采用RT PCR检测PPARγ和葡萄糖转运蛋白4(GLUT-4)mRNA表达,Western blot检测PPARγ蛋白表达;同位素示踪法检测细胞葡萄糖(Glu)摄取率变化.结果 IRI模型组心肌细胞PPARγ mRNA及蛋白表达较空白组不同程度增加(P均＜0.05);siRNA-PPARγ组,PPARγ mRNA及蛋白表达量较空载体组和IRI模型组明显下降(P＜0.01),空载体组PPARy mRNA及蛋白表达接近IRI模型组水平;GLUT-4 mRNA表达量空白组各时间点无明显差别,IRI模型组0 min表达量明显降低,之后随着再灌注时间增加逐渐恢复至空白组水平,空载体组GLUT-4 mRNA表达与IRI模型组无明显差别;沉默PPARγ后,细胞GLUT-4 mRNA表达较IRI模型组和空载体组减低更明显(P＜0.05),恢复较IRI模型组更慢.在胰岛素刺激下,与IRI模型组比较,siRNA-PPARγ组各时间点Glu摄取率均降低(P＜0.05),0 min下降49,78％,15 min、1h、2h分别降低38.94％、18.61％、11.54％,6h开始恢复至IRI模型组水平.空载体组与模型组比较Glu摄取率无明显差异.结论 沉默PPARγ的表达,可加重IRI心肌细胞胰岛素抵抗,其可能的机制是PPARγ基因沉默导致的GLUT-4 mRNA表达下降或转位障碍.
关键词： 成年大鼠心肌细胞 缺血再灌注 胰岛素抵抗 过氧化物酶体增殖物激活受体 转染
