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KSHV RTA上调宿主细胞Bcl-2表达的分子机制研究
目的 研究卡波氏肉瘤病毒(Kaposis's Sarcoma-Associated Herpesvirus,KSHV)编码的复制转录激活因子(replication and transcription activator,RTA)调控宿主细胞Bcl-2表达的分子机制.方法用实时聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹(Western blot)技术检测RTA转染的细胞、TPA诱导的KSHV阳性细胞Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平;采用PCR定点突变和荧光素酶报告基因技术,检测RTA对Bcl-2基因启动子活性的调节,并鉴定启动子序列中对RTA调控具有重要作用的顺式反应元件.结果 RTA转染的细胞、TPA诱导的KSHV阳性细胞Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平显著增高.RTA通过与Bcl-2基因启动子中CCN9GG反应元件结合激活Bcl-2的转录,这种激活作用呈剂量依赖性,并且P2启动子对RTA反式激活Bcl-2基因不可或缺.结论 KSHV RTA能够上调宿主细胞Bcl-2表达,CCN9GG样RTA反应元件和P2启动子对RTA调控Bcl-2表达具有重要作用.
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Notch1蛋白胞内段重组慢病毒载体的构建及其在原发性渗出性淋巴瘤细胞中的功能验证
目的:构建含Notch1胞内段(intracellular Notch1,ICN)基因的重组慢病毒载体,并检测其对Notch信号通路以及卡波氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)潜伏感染的原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)细胞增殖能力的影响.方法:从真核表达质粒pIP-Flag-ICN中扩增出ICN基因片段,并将其插入慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen(pHAGE)质粒中以构建重组质粒pHAGE-ICN.在人胚肾上皮细胞293T细胞中共转染重组质粒pHAGE-ICN、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G,获得表达ICN的重组慢病毒,采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度.以ICN重组慢病毒感染PEL细胞系BCP-1细胞,通过蛋白质印迹法检测ICN以及Notch信号通路下游靶蛋白的表达,采用细胞计数法检测过表达ICN对BCP-1细胞增殖能力的影响.结果:质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒pHAGE-ICN构建成功.通过慢病毒三质粒包装系统成功包装携带ICN基因的重组慢病毒,并经梯度稀释法测得病毒滴度约为2×107 TU/mL.以ICN重组慢病毒感染BCP-1细胞,蛋白质印迹证实ICN蛋白获得有效过表达,并且能够促进Notch信号通路下游靶蛋白Hes-1的表达.细胞计数结果显示,过表达ICN能显著增强BCP-1细胞的增殖能力.结论:成功构建了含ICN基因的重组慢病毒载体,重组慢病毒介导的ICN过表达能够增强Notch信号通路活性,并增强PEL细胞的增殖能力.
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卡波氏肉瘤病毒编码的miR-K7-3p重组慢病毒载体构建及其对血管内皮细胞增殖的影响
目的:构建卡波氏肉瘤病毒(KSHV)编码的miR-K7-3p的重组慢病毒载体,并检测其对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖能力的影响.方法:将miR-K7-3p的序列及互补序列插入miR-30茎环结构,以此为模板扩增出目的片段,插入慢病毒载体mpCDH-CMV-MCS-EF1-tRFP(简写为mpCDH,tRFP基因可表达红色荧光蛋白)中,构建重组慢病毒载体mpCDH-miR-K7-3p.将构建的目的质粒mpCDH-K7-3p与包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G共同转染人胚肾上皮细胞(293 T),包装表达miR-K7-3p的慢病毒.采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度.用包装成功的miR-K7-3p慢病毒感染HUVECs,荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-K7-3p的表达,CCK-8及平板克隆实验检测细胞增殖力.结果:双酶切鉴定、核酸序列测定与比对结果证实重组慢病毒质粒mpCDH-miR-K7-3p构建成功.qRT-PCR检测到重组慢病毒感染的HUVECs中miR-K7-3p的表达水平升高.增殖实验结果显示,miR-K7-3p慢病毒感染后的HUVECs增殖能力明显强于对照组.结论:miR-K7-3p可以明显促进HU-VECs的增殖.
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卡波氏肉瘤病毒 K9基因重组慢病毒表达载体的构建及其编码蛋白功能初探
目的：构建卡波氏肉瘤病毒（Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）K9基因的重组慢病毒载体，并探究 K9基因编码的病毒干扰素调节因子1（viral IFN regulatory factor 1，vIRF1）对人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）增殖的影响。方法：根据 K9基因的核酸序列设计聚合酶链式反应（PCR）的上下游引物。以实验室已有的真核表达载体 pCI-K9-Flag 为模板，PCR 扩增 K9基因序列。PCR 产物经限制性内切酶双酶切后插入慢病毒载体 pHAGE-CMV-MCS-Izs-Green（简称 pHAGE）中，构建重组慢病毒质粒 pHAGE-K9。将 pHAGE-K9质粒与包膜质粒 pMD2．G、包装质粒 psPAX2共同转染人胚肾上皮细胞（293 T 细胞），包装 K9基因的重组慢病毒。采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。慢病毒感染 HUVECs 后，观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达，蛋白质印迹法检测 HUVECs 中 K9编码的 vIRF1蛋白的表达。采用流式分选技术获得稳定表达 vIRF1蛋白的 HUVECs。运用细胞增殖实验检测 vIRF1对 HUVECs 增殖的影响。结果：核酸序列测定结果表明，重组慢病毒质粒 pHAGE-K9构建成功。蛋白质印迹结果显示，K9基因重组慢病毒感染 HUVECs 后其编码蛋白成功表达。细胞增殖实验结果表明，稳定表达 vIRF1的 HUVECs 增殖能力显著强于对照组。结论：KSHV K9基因编码的 vIRF1能够促进 HUVECs 的增殖。
关键词： 卡波氏肉瘤病毒 K9 基因 病毒干扰素调节因子 1 慢病毒 人脐静脉血管内皮细胞 细胞增殖 -
IκBα显性负相重组慢病毒载体的构建及其在NF-κB信号通路中的功能验证
目的:构建表达IκBα显性负相结构(dominant-negative construct,IκBα-DN)的重组慢病毒载体,并检测其对核转录因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的影响.方法:PCR扩增IκBα-DN片段并插入至pCDH-CMV-MCS-EFI-copGFP载体中.将构建的pCDH-IκBα-DN重组质粒与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293 T细胞,包装表达IκBα-DN的重组慢病毒,并用梯度稀释法检测病毒滴度.以慢病毒IκBα-DN感染293 T细胞,通过免疫印迹检测IκBα蛋白的表达量.将慢病毒IκBα-DN感染已转染有NF-κB虫荧光素酶报告质粒的293 T细胞,24 h后检测IκBα-DN对NF-κB活性的影响.进一步用慢病毒IκBα-DN感染表达卡波氏肉瘤病毒(Kaposi,s sar-coma-associated herpesvirus,KSHV)编码的病毒FLICE抑制蛋白(viral FLICE inhibitory protein,vFLIP)的人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),以检测IκBα-DN在NF-κB信号通路中的功能.结果:限制性内切酶鉴定以及核酸序列比对证实重组质粒pCDH-IκBα-DN构建成功.通过三质粒包装系统包装表达IκB α-DN的重组慢病毒,病毒滴度约为3×107 efu/mL.以慢病毒IκBα-DN感染293 T细胞,免疫印迹结果表明胞质中IκB α蛋白的表达量明显升高.虫荧光素酶报告实验结果提示,重组慢病毒介导的IκBα-DN能有效抑制NF-κB的活性.在表达KSHV vFLIP的HUVECs中,IκBα-DN也能显著减弱NF-κB通路信号.结论:成功构建的含IκBα-DN序列的慢病毒能够有效地感染293 T细胞和内皮细胞,且初步结果提示IκBα-DN能增加胞质内IκB的含量,并进一步抑制NF-κB信号的传递.
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重组慢病毒载体介导KSHV分子开关蛋白Rta在BCBL-1细胞中的表达及其功能鉴定
目的:构建含卡波氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)分子开关蛋白,即复制和转录激活蛋白(replication and transcriptional activator,Rta)基因的重组慢病毒载体.方法:从真核表达质粒pcDNA3.1-Rta 中扩增出Rta基因,插入pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中,构建重组慢病毒载体pHAGE-Rta.将重组慢病毒骨架质粒pHAGE-Rta与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293 T细胞,通过荧光显微镜观察表达绿色荧光蛋白的293 T细胞占总数的百分比.收集病毒悬液,采用梯度稀释法测定病毒滴度.以不同感染复数(MOI)的Lentivirus-Rta 病毒量感染BCBL-1细胞,72 h后检测Rta基因的表达,同时通过蛋白质印迹和病毒颗粒释放实验检测KSHV裂解期蛋白病毒白细胞介素-6(vIL-6)的表达及子代病毒颗粒的产出.结果:从真核表达质粒pcDNA3.1-Rta中扩增出Rta 基因,插入pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen后,酶切鉴定和核酸序列测定证实重组慢病毒骨架质粒pHAGE-Rta构建成功.通过慢病毒包装3质粒表达系统获得了表达Rta基因的重组慢病毒,滴度约为2×107 efu/mL.以不同MOI的重组慢病毒感染BCBL-1细胞,72 h后可检测到外源基因编码Rta蛋白的表达,且其表达能够上调KSHV vIL-6的表达水平及促进子代病毒颗粒的释放.结论:成功构建了含Rta基因的慢病毒表达载体,获得的重组病毒能够有效地感染BCBL-1细胞,并发挥激活KSHV裂解期复制的生物学功能.
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HIV-1 Tat基因重组原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与功能鉴定
目的:在大肠埃希菌中表达人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)反式激活蛋白(trans activative transcription protein,Tat),为进一步研究可溶性Tat在艾滋病相关卡波氏肉瘤(AIDS-KS)致病过程中的作用提供材料.方法:以本实验室保存的重组质粒pcDNA3.1(+)/Tat101为模板,PCR扩增目的基因Tat.将PCR产物克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-28a(+)-Tat.将重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹鉴定后,通过镍亲和层析柱纯化.纯化后蛋白采用虫荧光素酶报告实验进行功能验证.结果:限制性内切酶酶切和基因测序证实,成功构建了含有Tat基因的重组原核表达质粒.蛋白质印迹结果显示,His融合蛋白在大肠埃希菌中得到正确表达,纯化后获得了相对分子质量为18×103的融合蛋白.虫荧光素酶报告实验证实,Tat与HIV-1长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)具有结合能力.结论:重组质粒pET-28a(+)-Tat能在大肠埃希菌BL21(DE3)中稳定表达Tat蛋白,镍亲和层析柱纯化的His-Tat融合蛋白具有生物学功能.
