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单色多重荧光实时定量PCR测定端粒长度
目的 在罗氏LightCycler 480上建立单色多重荧光实时定量聚合酶链反应(MMQPCR)方法测定端粒长度.方法 在罗氏480定量PCR仪上使用MMQPCR方法测定39例人外周血白细胞端粒长度(相对T/S比值),并与DNA印迹法(Southern blot)测得的平均末端限制性片段(TRF)长度作比较.结果 MMQPCR方法测定端粒长度相对T/S比值为1.13±0.21,Southern blot方法测量平均TRF长度为(7.46±1.21)kb,两种方法测定结果的相关性分析R2=0.6706(P＜0.001).结论 本研究建立的MMQPCR方法测定端粒长度重复性好、省时、简便、可靠,可高通量处理大量样品.
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实验树鼩空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR方法的建立
目的 为实验树鼩微生物检测提供一种快速、简便、灵敏,并且特异性强的空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR检测方法.方法 根据空肠弯曲菌的HipO区域、沙门菌的inV区域和志贺菌的ipaH区域设计特异性引物和探针,并进行单病原定量PCR检测验证;后分析多重PCR的灵敏度和特异性,并使用该多重PCR方法检测实验树鼩样品.结果 本研究的PCR要素可用于空肠弯曲菌、沙门氏菌及志贺菌等单种菌的实时荧光定量PCR扩增.多重定量PCR扩增出了空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺氏菌标准扩增曲线;该方法的灵敏度为1×103 ng/μL;特异性检测未从其他参考菌株中检出阳性.结论 该多重定量PCR方法在实验树鼩微生物检测中具有很好的应用和推广前景.
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不同液化处理及核酸共提取方法对痰样本中病毒核酸的提取效果比较
目的 比较不同痰液液化方法及不同核酸提取方法共提取痰液中病毒RNA和DNA的效果,并比较其优劣.方法 将痰液样本分为二硫苏糖醇(DTT)、氢氧化钠(NaOH)液化痰液组,以生理盐水为对照,分别使用TTIANamp Virus DNA/RNA Kit(方法1)、KBW酶法(方法2)、KBW通用法(方法3)和单一核酸提取试剂盒(方法4)提取核酸,微量核酸分析仪检测核酸纯度,多重定量PCR方法检测核酸的浓度.结果 核酸纯度测定结果:生理盐水组中方法2和方法3,DTT处理组中方法1和方法2,NaOH处理组中方法3所提DNA纯度略大于1.8;各组中采用方法1所提RNA纯度均明显超过2,方法4及NaOH处理组中方法3所提RNA纯度均低于1.8,其余纯度均在正常范围内.PCR浓度测定结果:腺病毒(DNA)Ct值:生理盐水组＜NaOH处理组(q=35.09,P＜0.05),生理盐水组和DTT处理组间差异无统计学意义(q=2.54,P＞0.05);提取方法1＜方法3(q=12.68,P＜0.05),方法1、方法2与方法4之间差异无统计学意义(q=0.84、1.69、2.53,P＞0.05);呼吸道合胞病毒(RNA)Ct值:生理盐水组＜DTT组＜NaOH组(F=152.76,P＜0.01);提取方法1＜方法2＜方法3(q=6.98、3.75,P＜0.05),方法2与方法4之间差异无统计学意义(q=1.28,P＞0.05).结论 痰液液化前处理会影响病毒RNA和DNA的共提取,TIANamp Virus DNMRNA Kit和KBW酶法对痰样本中病毒核酸共提取效果较好.
