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miR-186靶向PIG11基因抑制胃癌MKN-28细胞侵袭的作用
目的研究miR-186靶向PIG11基因抑制胃癌细胞的侵袭。方法首先通过生物信息学方法分析，寻找与PIG11（TP53I11）结合的靶miRNAs。分别构建miR-186 mimics、点突变序列（Point mutation，PM）、空白载体（Scramble），转染胃癌MKN-28细胞。qRT-PCR检测miR-186表达，Western blot 检测PIG11表达，分析miR-186表达和PIG11表达之间的相关性。 Transwell检测转染前后各组胃癌MKN-28细胞侵袭能力变化。结果生物信息学发现12个miRNAs可能是PIG11的潜在靶miRNAs，其中miR-186与PIG11结合特异性好、稳定性强；MKN-28-miR-186 mimics细胞株中miR-186表达增高，而PIG11表达下调，而MKN-28、MKN-28-miR-Scramble、MKN-28-miR-186-PM 3个细胞株中miR-186表达水平较低，而PIG11表达水平较高。 MKN-28-miR-186 mimics侵袭细胞计数明显低于其他3组（P＜0.05）。结论 miR-186有可能靶向结合PIG11，下调其表达并抑制胃癌细胞的侵袭。
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PIG11、Caspase-3蛋白在胃癌中的表达及临床意义
目的:探讨PIG 11、Caspase-3蛋白在胃癌中的表达及临床意义.方法:采用免疫组织化学SP法检测80例胃癌组织、36例正常胃黏膜组织、30例肠上皮化生组织及31例异型增生组织中PIG 11、Caspase-3蛋白的表达水平,并分析其表达与胃癌临床病理特征的关系及两者之间的相关性.结果:胃癌组织中PIG 11、Caspase-3蛋白的阳性表达率均显著低于正常胃黏膜、肠上皮化生及异型增生组织(P＜0.01);PIG11、Caspase-3蛋白表达水平与胃癌的分化程度、临床分期、有无淋巴结转移及远处转移密切相关(P＜0.05),但与患者的年龄、性别及肿瘤的浸润深度无关(P＞0.05);PIG11、Caspase-3蛋白在胃癌组织中的表达呈正相关(r=0.859,p＜0.01).结论:PIG11、Caspasc-3蛋白在胃癌中明显表达下调,且与胃癌的分化程度、临床分期、有无淋巴结转移及远处转移密切相关,可能作为胃癌预后评估的参考指标.PIG11表达下调可能通过抑制Caspase-3的表达促进胃癌的发生和发展.
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新抑癌基因PIG11高表达HepG2细胞株的建立
目的 构建人PIG11逆转录病毒载体,建立高表达PIG11基因的HepG2细胞,为进一步研究PIG11基因在肝癌细胞中的功能提供一个理想的试验平台.方法 将已有的peDNA3.1/NT-GFP-PIG11质粒用PCR法扩增出PIG11片段,构建含人PIG11 cDNA的重组质粒pLXSN-PIG11.重组载体经PCR鉴定和DNA测序分析.将该重组质粒用lipofeetamineTM2000转染包装细胞PA317,获得pLXSN-PIG11逆转录病毒.用病毒感染HepG2细胞,获得PIG11高表达的HepG2细胞株.结果 获得384 bp人PIG11基因,测序证明PIG11cDNA编码序列与Genbank中报道的一致,转染PA317细胞后用病毒上清感染HepG2细胞,经RT-PCR检测发现HepG2细胞中PIG11 mRNA表达明显升高.结论 成功构建了高表达PIG11基因的HepG2细胞株,为进一步研究其生物学行为奠定了基础.
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PIG11蛋白在人体正常组织及其相应肿瘤组织中表达的研究
目的 检测PIG11(p53-induced gene 11)蛋白在人体正常组织及其相应肿瘤组织中的表达情况,探讨PIG11蛋白在人体正常组织的分布特点,及在肿瘤发生发展中所起的作用.方法 利用免疫组化SP法检测PIG11蛋白在319例人体正常组织及其相应肿瘤组织中的表达.结果 PIG11蛋白在胃、肠、肝、乳腺等腺上皮及鳞状上皮组织中明显表达阳性,在正常胃黏膜腺颈部较体部和底部表达降低.在纤维、脂肪、平滑肌、淋巴组织及脑组织中无明显表达.PIG11蛋白在肝癌、低分化胃和肠腺癌、乳腺癌组织中较相应正常组织均有明显表达下调(P＜0.01);在鳞癌组织中,与正常鳞状上皮比较,也有表达下调(P＜0.05).结论 PIG11蛋白主要分布在人体上皮组织,且与细胞的分化程度有关;PIG11蛋白低表达与上皮源性的恶性肿瘤发生发展有关.
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PIG11高表达诱导HepG2细胞凋亡及其机制的初步探讨
目的 利用已建立的稳定高表达PIG11蛋白的HepG2细胞株,探讨PIG11蛋白表达对HepG2细胞凋亡的影响,以及线粒体膜电位改变和Cyt C释放在凋亡过程中的作用.阐明PIG11诱导细胞凋亡的分子机制.方法 PI染色,流式检测细胞的凋亡情况.用Rh123标记,流式测定线粒体膜电位.Western Blot检测胞浆和线粒体中Cyt C的含量变化.结果 流式细胞仪检测Rh123荧光强度,结果显示:pLXSN-PIG11-HepG2细胞荧光强度(5.4±0.15)低于HepG2细胞(14.7±0.56)和pLXSN-HepG2细胞(13.2±0.53)(P＜0.01).表明PIG11高表达诱导细胞凋亡过程中存在线粒体膜电位去极化.用CsA(10 μmol/L)抑制各组细胞的线粒体通透性转移孔后,流式凋亡检测结果显示pLXSN-PIG11-HepG2细胞凋亡率明显降低.Western Blot检测发现存在线粒体Cyt C向胞浆释放.结论 PIG11高表达可诱导HepG2细胞凋亡,PIG11诱导细胞凋亡机制可能由线粒体膜电位改变及Cyt C向胞浆释放而介导.
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HepG2细胞中PIG11相互作用蛋白质的初步分离与鉴定
目的 探讨人肝细胞癌细胞系(HepG2)并初步鉴定候选肝癌抑癌蛋白肿瘤蛋白P53下游靶基因11号(PIG11)相互作用蛋白,确定PIG11的作用方式. 方法 课题组前期利用质粒pLXSN构建逆转录病毒载体,转染细胞后建立起PIG11高表达HepG2细胞株.将HepG2分为HepG2对照组,空载体HepG2组和PIG11高表达HepG2组分别培养,流式细胞术检测细胞凋亡.采用免疫共沉淀富集HepG2细胞中PIG11结合蛋白,切取PIG11结合蛋白条带,胶内酶解后进行电喷雾串联质谱得到肽序列标签,通过数据库查询蛋白. 结果 PIG11蛋白高表达组凋亡率显著高于对照组 (P<0.01). 串联质谱后数据库查询鉴定出11个蛋白,分别是热休克蛋白家族中的HSP60,KH型剪接调节蛋白(KSRP)、脑酸溶性蛋白BASP1、蛋白水解诱导因子(PIF/DCD)、Y染色体RNA结合蛋白、碳酸酐酶、白蛋白以及骨架蛋白中的波形蛋白、α、β-微管蛋白、肌动蛋白. 结论 PIG11蛋白高表达对HepG2具有诱导凋亡作用;初步鉴定出11个PIG11结合蛋白,为进一步阐明PIG11蛋白的作用机制提供线索.
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Caspase-8和Bcl-2在PIG11诱导HepG2细胞凋亡中的作用
目的:利用本实验室已建立PIG11蛋白稳定低表达的HepG2细胞株和PIG11蛋白稳定高表达HepG2细胞株,研究Caspase-8和Bcl-2在PIG11诱导HepG2细胞凋亡中的作用,进一步探讨PIG11基因表达对HepG2细胞凋亡的机制.方法:细胞培养,分组:HepG2细胞、pLXSN-PIG11-HepG2(pLXSN-PIG11转染建立PIG11蛋白高表达HepG2细胞)、pLXSN-HepG2(pLXSN空载体转染HepG2细胞)、miR-PIG11-HepG2(miRNA干扰PIG11蛋白低表达HepG2细胞)、miR- HepG2(干扰空载体HepG2细胞).Hoechst 33342染色荧光和PI染色流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况.Western blot检测Caspase-8蛋白、Bcl-2蛋白的表达情况.结果:Hoechst 33342染色荧光显微镜下pLXSN-PIG11-HepG2细胞组可见核染色质浓缩,核碎片,荧光增强,以及凋亡小体.PI染色流式细胞仪检测结果显示:HepG2细胞、miR-PIG11-HepG2细胞、miR -HepG2细胞、pLXSN-PIG11-HepG2细胞、pLXSN-HepG2细胞的凋亡率分别为5.72%±0.81%、1.34%±0.71%、5.10%±0.40%、34.83%±2.29%、5.34%±0.60%.PIG11高表达的pLXSN-PIG11-HepG2细胞组凋亡率比其它各组增高(P<0.01),PIG11低表达的miR-PIG11-HepG2细胞组凋亡率降低(P<0.01).Western blot检测结果显示PIG11高表达的pLXSN-PIG11-HepG2细胞Caspase-8蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调(P<0.01),PIG11低表达的miR -PIG11- HepG2细胞Caspase-8蛋白的表达下调,Bcl-2蛋白表达上调(P<0.01).结论:PIG11蛋白高表达能诱导HepG2细胞凋亡,其机制可能与Caspase-8蛋白及Bcl-2蛋白表达相关.
