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Trizol RNA提取法在雪貂组织的流感病毒H3N2定量PCR检测中优于RNeasy mini kit(Qiagen)柱子法
目的 比较RNeasy mini kit (Qiagen)柱子法和Trizol法提取RNA在雪貂肺和肠组织H3N2 SYBR Green PCR定量中的去干扰作用,从而找到适合该定量体系的RNA提取方法.方法 比较Trizol法,RNeasy mini kit柱子法,改良RNeasy mini kit柱子法1和改良RNeasy mini kit柱子法2提取肺肠组织RNA的质量,RNA逆转录成cDNA后,利用SYBR Green PCR方法检测样品中H3N2的载量,比较产物的特异性,综合评价RNA提取方法.结果 4种方法提取的肺和肠组织的RNA质量不相同,紫外分光光度仪测得RNeasy mini kit柱子法提取的RNA 的A260/280低于1.8,其余3种方法的A260/280在1.8～2.1之间,A260/230只有Trizol法能达到2.0左右,其余3种方法均远低于2.0.电泳可见Trizol法提取的RNA有3条带:28 s、18 s和5 s,而RNeasy mini kit柱子法的RNA除了有28 s、18 s外,还有基因组DNA,改良RNeasy mini kit柱子法1和2提取的RNA只有28 s和18s带.RNA逆转录后进行荧光定量PCR,从溶解曲线看,不论是鼻甲刮取物还是肺肠组织的样品模板,4种方法获得的样品与标准品均为单一峰溶解曲线峰,并且波峰位置重叠.而鼻甲刮取物定量的产物跑琼脂糖凝胶电泳均为单一的特异性条带,而肺肠组织的产物电泳发现:Trizol法获得的模板定量产物与标准品一致,为单一的特异性条带,而其它3种方法获得的模板则均有非特异性条带.结论 鼻甲刮取物的病毒定量选用RNeasy mini kit柱子法提取定量结果与Trizol法一样可靠,说明对于简单样品该体系及引物非常适用,结果可信.对于组织样品肺和肠,Trizol法获得的样品定量结果比其它3种方法可靠.
关键词： 雪貂 H3N2 RNA提取 SYBR Green荧光定量PCR
