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二氢生物喋呤还原酶参与调控HEK293T细胞自噬作用的初步研究
目的 探讨二氢生物喋呤还原酶(dihydropteridine reductase,QDPR)对HEK293T细胞自噬作用的影响.方法 构建野生型QDPR和突变型QDPR重组质粒分别转染HEK293T细胞,并设空载体对照组.采用RT-PCR及Western blot方法检测空载体组,野生型QDPR组和突变型QDPR组自噬相关蛋白LC3和Beclin 1的表达量变化.结果 1)测序结果证实PCR扩增得到编码正常QDPR的cDNA序列正确以及突变的cDNA也在正确的位置突变;2)磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,野生型QDPR和突变型QDPR融合蛋白成功表达;3)RT-PCR 结果显示,与对照组相比,野生型QDPR组LC3基因水平明显上调(P<0.05),突变型QDPR组LC3基因水平与对照组相比无统计学差异;与对照组相比,野生型和突变型组Beclin1基因水平无统计学差异;4)Western blot结果显示,与对照组相比,野生型QDPR组LC3-II和Beclin1的蛋白表达量明显上调(P<0.05),但LC3-I的蛋白表达量无统计学差异,突变型QDPR组与对照组相比LC3-I,II和Beclin1的蛋白表达量均没有统计学差异(P>0.05).结论 二氢生物喋呤还原酶能增强HEK293T细胞自噬相关基因LC3和Beclin 1的表达,提示其可能具有激活自噬作用的功能;二氢生物喋呤还原酶93位氨基酸的突变影响了其对细胞自噬作用的调控,降低了自噬标志分子LC3-I和Beclin1的基因表达.
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QDPR 基因表达水平对肾小管上皮细胞系 NRK-52 E细胞 DHFR 表达的影响
目的： OLETF大鼠醌式二氢生物喋呤还原酶（ Quinoid dihydropteridine reductase， QDPR）存在K93T点突变，QD-PR催化醌型二氢生物喋呤还原成四氢生物喋呤（tetrahydrobiopterin，BH4）；二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）能将二氢喋呤还原成BH4，提示生物喋呤代谢与叶酸代谢通路之间有串扰。文中通过研究QDPR基因表达水平对肾小管上皮NRK-52E细胞DHFR表达的影响，探讨QDPR基因在糖尿病肾病（ diabetic nephropathy ，DN）中的作用机制。方法 Western blot检测高糖环境下NRK-52E细胞及OLETF大鼠DHFR蛋白表达情况。利用慢病毒技术感染NRK-52E细胞，制作空载过表达、过表达QDPR敲低随机序列对照和敲低QDPR模型。每组再分别给予5．4 mmol／L正常糖培养基和30 mmol／L高糖培养基培养细胞72 h，模拟DN模型。实验分组：NRK-52E对照组、NRK-52E高糖组、空载过表达病毒对照组、空载过表达病毒高糖组、QDPR基因过表达组、QDPR基因过表达高糖组、敲低随机序列对照组、敲低随机序列高糖组、QDPR基因敲低组、QDPR基因敲低高糖组。观察高糖环境QDP R基因的表达情况对DHFR蛋白表达水平的影响。结果 NRK-52E高糖组DHFR蛋白含量（0．33±0．16）低于NRK-52E对照组（0．64±0．05），差异有统计学意义（P＜0．05）；OLETF大鼠DHFR蛋白的表达水平（1．03±0．12）明显低于LETO大鼠的表达水平（1．56±0．16），差异有统计学意义（P＜0．01）。与空载过表达病毒高糖组（0．63±0．08）相比，QDPR基因过表达高糖组DHFR蛋白含量（0．12±0．09）降低，差异有统计学意义（ P＜0．01）；与敲低随机序列对照组（0．52±0．08）相比，QD PR基因敲低高糖组DHFR表达量（0．62±0．27）差异无统计学意义（P＞0．05）。结论DHFR蛋白在DN的发生发展中可能起到重要作用，QDPR基因过表达使DHFR蛋白表达含量下降，QDPR基因过表达通过下调DHFR蛋白的表达水平进而影响DN的发展。
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二氢生物喋呤还原酶减轻脂肪酸诱导的细胞凋亡的机制研究
目的 探讨二氢生物喋呤还原酶(QDPR)高表达对脂肪酸(PA)诱导的细胞凋亡的作用.方法 HEK293T细胞转染实验分为A、B、C 3组,A组为空载体转染组,B组为经过PA刺激的空载体转染组,C组为经过PA刺激的QDPR重组质粒转染组.首先将空载体及构建的QDPR重组质粒分别转染至HEK293T细胞,培养24 h后采用0. 5 mmol/L PA刺激上述细胞,将没有经过PA刺激的空载体组细胞、PA刺激的空载体组细胞和PA刺激QDPR重组质粒组细胞三组细胞继续培养24 h后收集细胞.采用四氢生物喋呤(BH4)和活性氧簇(ROS)检测试剂盒检测3组BH4和ROS的生成量;采用Western blot法检测3组凋亡相关蛋白Beclin 1 、Caspase 3和Beclin 2的表达.结果 ①转染细胞后,QD-PR融合蛋白成功表达;②与A组相比,B组的BH4生成量差异无统计学意义;与B组相比,C组BH4生成量明显增多(P<0.05);③与A组相比,B组的ROS生成量明显增加(P<0.05);与B组相比,C组ROS生成量明显下降(P<0. 05);④Western blot结果显示:与A组相比,B组经过PA刺激后细胞中Beclin 1和Caspase 3表达水平显著上调(P< 0.05),Beclin 2表达水平下降(P<0. 05);QDPR过表达后C组Beclin 1和Caspase 3表达水平显著下调(P<0. 05) , Beclin 2表达水平升高(P<0.05).结论 QDPR高表达后,可以刺激BH4的生成,同时能降低PA诱导的ROS的生成量,还可以降低细胞凋亡相关蛋白Beclin 1和Caspase 3的表达,增强抗凋亡蛋白Beclin 2的表达,提示其可能通过调节 BH4和ROS含量影响细胞凋亡.
