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线粒体转录复合物相关蛋白原核表达与纯化
目的 获取人线粒体转录因子A(TFAM)、线粒体转录因子B1(TFB1M)、线粒体转录因子B2(TFB2M)基因片段,高效表达和纯化带有谷胱甘肽转移酶(GST)标签的GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白.方法 设计引物扩增得到TFAM、TFB1M、TFB2M的cDNA片段,通过引入的酶切位点克隆至表达载体pET42a,构建重组表达载体,并导入E.coli BL21宿主菌中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组的GST融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠纯化表达产物,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析鉴定.结果 获得pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M、pET42a-TFB2M表达质粒,测序结果与GenBank的基因序列一致.SDS-PAGE分析结果显示,重组GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白分别在相对分子质量56000、67000、69000处出现特异性蛋白条带,经GST亲和层析纯化后,得到高纯度的融合蛋白.结论 成功构建了基因重组体pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M、pET42a-TFB2M,制备了GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白.
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线粒体转录复合物各因子质粒标准品的构建
目的：构建大鼠线粒体转录因子 TFAM（A）、线粒体转录因子 TFB1M （B1）、线粒体转录 TFB2M （B2）及线粒体RNA 聚合酶（POLRMT）的质粒标准品，为检测内耳细胞线粒体 TFAM、TFB1 M、TFB2M、POLRMT 的 mRNA 表达水平做基础。方法：设计特异性引物和探针，提取大鼠内耳组织总 mRNA 逆转录成 cDNA，PCR 扩增、纯化目的片段，将纯化产物与 pZer-oBack ／blunt 载体重组，提取重组质粒，经测序鉴定后，用实时荧光绝对定量 PCR 建立标准曲线。结果：测序结果与各目的序列一致，获得良好的标准曲线（R2＞0．99）。结论：成功构建了各目的基因的质粒标准品。
