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基于质粒标准品的HEV实时定量逆转录PCR检测方法的建立
目的 建立戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)不同基因型RNA实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测方法及其所需质粒标准品,以利于临床一线实验室展开应用.方法 选取HEV ORF3高度保守区设计可检测HEV不同基因型病毒株的引物和探针;将拟扩增的HEV RNA目的基因片段构建成质粒,制备HEV质粒DNA标准品,用于浓度标准曲线及一步法qRT-PCR检测方法的建立;同时检测并分析HEV核酸与抗原和抗体之间的相关性;采用逆转录-巢式PCR(RT-nPCR)进行对比验证,并对部分阳性标本进行测序,通过生物进化树分析其流行病学特点.结果 成功建立基于HEV质粒标准品的qRT-PCR检测方法,适用于血清及粪便标本,低检测限可达25拷贝/test;HEV核酸与抗原的检测结果具有较好的相关性,两者一致性达77.8%;经生物进化树分析发现9位HEV RNA阳性患者均感染为基因4型,但分属4a、4d和4n三个不同的基因亚型.结论 成功建立基于HEV质粒标准品的qRT-PCR检测方法,为后续临床应用商品化提供技术支持.
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叉头转录因子1质粒标准品的构建
背景:研究表明叉头转录因子1是一种新的2型糖尿病易感基因,但2型糖尿病患者与健康人的叉头转录因子1基因在转录水平上差异性的研究不多.由于还没有商品化叉头转录因子1的质粒标准品,因此有必要构建其标准品.目的:构建应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测叉头转录因子1 mRNA的质粒标准品.设计、时间及地点:单一样本重复实验,于2007-1 1/2008-03在苏州大学附属第一医院检验科实验室完成.材料:SYBR ExScriptTM反转录-聚合酶链反应Kit试剂盒,SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒,凝胶回收纯化DNA试剂盒,质粒DNA小量纯化试剂盒,PMDl8-T Vector试刺盒等.方法:从健康志愿者血标本中提取总RNA,反转录合成cDNA,以cDNA为模板应用聚合酶链反应扩增出目的片段,对其回收纯化连接到PMD18-T载体及转化JMl09,阳性克隆经测序分析,确认重组质粒正确.抽提重组质粒,用紫外分光光度仪测定其浓度,再根据公式换算成拷贝浓度,后稀释成梯度标准品.主要观察指标:重组质粒聚合酶链反应和基因测序结果,标准品标准曲线的相关系数及标准品的重复性.结果:成功构建了叉头转录因子1质粒标准品,通过聚合酶链反应及基因测序鉴定其目的片段已成功插入载体.各稀释度的标准品经荧光定量-聚合酶链反应扩增后,其循环阈值与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,线性范围是2.39×(105-1012)copies/mL.各稀释度标准品的批内重复性好,其变异系数范围为0.29%～1.16%.结论:实验成功构建了具有较好灵敏度和重复性的叉头转录因子1质粒标准品.
关键词： 质粒标准品 叉头转录因子1 荧光定量-聚合酶链反应 -
肉制品中沙门菌实时荧光定量聚合酶链反应标准质粒的构建
目的 制备用于检测肉制品中沙门菌实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准质粒.方法 设计针对沙门菌invA基因的引物,扩增特异片段,转入质粒载体中构建重组质粒.将构建的重组质粒作为标准品,进行优化后的实时荧光定量PCR,建立标准曲线,并考察该标准品灵敏性及稳定性.结果 成功构建含有沙门菌invA基因的质粒标准品,用其建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板的拷贝数呈良好线性关系(r2=0.9979),低可以检出10 拷贝/反应.该标准质粒经验证具有良好的稳定性.用该质粒标准品检测肉制品中的沙门菌,经2 h增菌后,可在7 h内完成对样品的检测.结论 所构建的质粒标准品可用于荧光定量PCR检测肉制品中的沙门菌,为考量实验质量提供参考依据.
关键词： 质粒标准品 荧光定量聚合酶链反应 沙门菌 肉制品 -
实时荧光定量PCR检测人APRILmRNA的标准品构建
目的:构建增殖诱导配体(APRIL)基因的重组质粒的标准品.方法:从肺癌的组织标本中抽提总RNA逆转录合成cDNA,以cDNA为模板扩增目的片段,从胶中回收目的片段,再将回收的目的片段与pGEM-T Easy载体连接并转化宿主菌DH-5α,分别用菌落PCR及测序两种方法证实目的片段已成功转染细菌.抽提重组质粒DNA用核酸分析仪测浓度后换算成copies/ml.结果:成功构建了APRIL实时荧光定量标准品的线性范围105～1012copies/ml,批内与批间CV分别为1.34%～3.07%和7.24%～11.41%.结论:该法制备的质粒标准品具有较好的灵敏度和重复性,满足实时荧光定量实验要求.
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实时荧光定量PCR测定TRAIL mRNA质粒标准品的构建
目的 构建pGEM-T-TRAIL重组质粒标准品为临床检测TRAIL mRNA水平奠定基础.方法 在TRAIL基因第二和第三外显子区设计特异性引物和荧光探针,提取血清HBV DNA阳性乙肝患者的外周血单个核细胞总RNA,逆转录合成cDNA,扩增目的 片断,纯化PCR产物与pGEM-T Easy载体连接,转化感受态菌DH - 5α,经蓝白斑筛选,PCR鉴定阳性克隆,并进一步测序分析.提取重组质粒测定DNA浓度后,10倍倍比稀释,建立TRAIL质粒标准品.结果 扩增目的 片段长度为110 bp,测序结果证实所构建的质粒序列与NCBI基因库TRAIL序列性一致.结论 成功构建了实时荧光定量PCR 测定TRAIL mRNA质粒标准品.
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人类疱疹病毒8型实时荧光定量PCR外标准品的构建
目的 构建人类疱疹病毒8型(HHV-8)基因质粒标准品,以便快速、灵敏、可靠地检测与HHV-8相关疾病患者的病毒载量.方法 提取HHV-8基因组DNA,以HHV-8 ORF26为目的基因设计引物,进行PCR扩增；纯化目的片段与pMD19-T Vector连接并转化到大肠杆菌中；提取重组质粒DNA,并行PCR、测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,实时荧光定量PCR(Real-time FQ-PCR)构建标准曲线.结果 HHV-8 ORF26目的片段制备成功,获得稳定的重组质粒,保证了目的片段的特异性和序列完整性,标准曲线参数良好,外标准品阈值循环数(Ct)与其相应梯度稀释浓度呈良好的线性关系,扩增效率高.结论 成功构建了HHV-8的Real-time FQ-PCR外标准品,可以快速检测样品中的HHV-8载量.
关键词： 人类疱疹病毒 人类疱疹病毒8型基因 质粒标准品 实时荧光定量PCR 卡波西肉瘤 -
CRL F2实时定量PCR检测方法的建立及初步应用
目的：建立人细胞因子受体样因子2（CRLF2）实时定量 PCR检测方法。方法设计特异性引物扩增目的基因CRLF2及管家基因ABL ，将纯化的PCR产物进行TA克隆，经菌落PCR筛选并测序鉴定后，提取重组质粒DNA ，紫外分光光度计检测浓度换算成copies／mL浓度，稀释制备成质粒标准品，制作标准曲线观察灵敏度和线性范围，同时对质粒标准品的稳定性进行评估。初步应用该方法检测10例健康儿童和10例急性淋巴细胞白血病（ALL）初诊儿童的骨髓单个核细胞CRLF2水平。结果 CRLF2 PCR产物具有单一特异的熔解曲线；标准品的线性检测范围为103～108 copies／mL ；质粒标准品反复冻融3次仍旧稳定；临床标本的 CRLF2水平均在标准品线性检测范围。结论该实验室建立的 CRLF2实时定量 PCR检测方法具有良好的特异性、线性范围和稳定性，可应用于临床 ALL 儿童CRLF2基因的定量检测。
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线粒体转录复合物各因子质粒标准品的构建
目的：构建大鼠线粒体转录因子 TFAM（A）、线粒体转录因子 TFB1M （B1）、线粒体转录 TFB2M （B2）及线粒体RNA 聚合酶（POLRMT）的质粒标准品，为检测内耳细胞线粒体 TFAM、TFB1 M、TFB2M、POLRMT 的 mRNA 表达水平做基础。方法：设计特异性引物和探针，提取大鼠内耳组织总 mRNA 逆转录成 cDNA，PCR 扩增、纯化目的片段，将纯化产物与 pZer-oBack ／blunt 载体重组，提取重组质粒，经测序鉴定后，用实时荧光绝对定量 PCR 建立标准曲线。结果：测序结果与各目的序列一致，获得良好的标准曲线（R2＞0．99）。结论：成功构建了各目的基因的质粒标准品。
