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白细胞介素-23基因修饰树突细胞获取凋亡癌细胞抗原诱导的抗胰腺癌免疫治疗
目的探讨白细胞介素23(IL-23)基因转染的树突状细胞(DC)负载凋亡癌细胞抗原后诱导的免疫应答对小鼠胰腺癌的治疗作用.方法克隆并构建IL-23基因真核双表达载体,转染DC后检测其表型及自分泌IL-23和IL-12的能力;观察各组脾脏T淋巴细胞γ干扰素(IFN-γ)和IL-4的分泌量以及DC诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对胰腺癌细胞的杀伤作用.转染DC并负载肿瘤抗原后制备成疫苗对小鼠抗肿瘤的免疫保护作用和肿瘤抑制作用.结果基因测序证实IL-23基因克隆及双表达载体构建成功,转染后DC对共刺激分子MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达增强;DC自分泌IL-23和IL-12的能力显著增强.DC介导的免疫应答促进了IFN-γ生成型Th1细胞的产生,IL-23转染组每24 h IFN-γ的分泌(高为535 pg/ml/106)与其他各组比较(对照组每24 h为60 pg/ml/106),P<0.01;转染的DC疫苗在体内诱导出高水平的CTL活性(P<0.05).接种IL-23修饰DC疫苗后小鼠的免疫防御能力显著增强;对肿瘤的生长有明显抑制作用,治疗组荷瘤鼠生存期与其他各组比较差异有显著意义.结论 IL-23使DC抗原递呈能力更强, IL-23修饰DC疫苗可强化宿主针对特异肿瘤的CTL免疫应答,使宿主不仅产生防御性免疫反应而且增强自动免疫能力.
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白细胞介素-23基因的克隆及真核双表达载体的构建
[目的]通过分别克隆白细胞介素-23(IL-23)基因的双亚基p19和p40,构建pcDNA3-IL-23真核双表达载体,为通过IL-23基因转染树突状细胞(dendritic cell, DC)增强其介导的免疫抗肿瘤作用提供基础.[方法]一步法从小鼠脾脏及胸腺中提取p19和p40总RNA,RT-PCR法扩增p19和p40的cDNA,扩增产物与pMD18-T vector连接并热转化至大肠杆菌JM109, PCR法筛选阳性克隆,提取质粒并进行DNA的测序鉴定,将pMD18-p19和pMD18-p40分别限制性酶切,在对pcDNA3表达载体限制性酶切后将切胶回收的p19和p40片段分别克隆至pcDNA3.0表达载体, 对阳性质粒进行XhoI/KpnI双酶切检测,琼脂糖凝胶电泳分析.[结果]脾脏及胸腺中提取p19和p40总RNA电泳鉴定是完整的,克隆的p19和p40 cDNA经测序鉴定与Genebank中序列完全一致.构建的pcDNA3.0-p19和pcDNA3.0-p40质粒分别限制性酶切后得到了593 bp和1028 bp的基因片段;构建的pcDNA3.0-IL-23表达载体限制性酶切后得到了1.62 kbp的p19+p40片段.[结论]成功克隆了小鼠IL-23基因,并分别构建了pcDNA3-p19、pcDNA3-p40和pcDNA3-IL-23真核表达载体,为IL-23基因转染DC来增强其免疫活性创造了条件.
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逆转录病毒介导的小鼠IL-23基因在鼠高转移性乳腺癌细胞系MA-891中的表达
目的:建立表达小鼠IL-23基因的鼠乳腺癌细胞系IL-23/MA-891,探讨外源性IL-23基因对MA-891细胞生长及其生物学性状的影响.方法:将插入IL-23基因的质粒,应用逆转录病毒载体LXSN经感染ψ2(ecotropic)和PA317(amphotropic) 两种包装细胞包装,经G418筛选获得表达IL-23分子的PA317阳性细胞克隆,用IL-23/PA317培养上清转染MA-891细胞,获得表达IL-23的IL-23/MA-891细胞.分别用RT-PCR法、ELISA法和免疫组化染色法分析IL-23/MA-891细胞表达IL-23的mRNA和蛋白的水平,筛选出高表达IL-23的IL-23/MA-891细胞克隆用于下层研究中;用流式细胞仪检测MA-891细胞中MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CD80、CD86以及FAS蛋白的表达、细胞周期变化及细胞凋亡情况;用ELISA法检测IL-23/MA-891细胞培养上清诱导脾细胞分泌IFN-γ的能力,用MTT比色法检测细胞增殖反应.结果:外源性IL-23基因转染的小鼠乳腺癌细胞系IL-23/MA-891,在mRNA水平和蛋白水平均可获得稳定表达;IL-23/MA-891细胞与LXSN/MA-891和MA-891比较,细胞周期及细胞凋亡率无显著性差异(P>0.05),H-2Kb(MHCⅠ类分子)、I-Ab( MHCⅡ类分子)、CD80、CD86以及FAS蛋白的表达水平无显著性差异(P>0.05);IL-23/MA-891细胞的增殖反应与LXSN/MA-891和MA-891细胞相比虽有所降低,但无显著性差异(P>0.05).然而,IL-23/MA-891细胞的培养上清可明显促进小鼠脾细胞分泌IFN-γ(P<0.01).结论:建立的稳定表达IL-23的IL-23/MA-891细胞,具有较强的免疫学调节活性,其生物学形状与MA-891和LXSN/ MA-891细胞相比较没有明显差异,但可进一步用于肿瘤相关免疫基因治疗的研究.
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凋亡癌细胞抗原致敏IL-23基因转染的树突细胞抗肿瘤免疫反应的研究
目的:探讨IL-23基因转染的树突状细胞(DC)负载癌细胞抗原后诱导的免疫应答对小鼠胰腺癌细胞的抑制作用.方法:克隆并构建IL-23基因真核双表达载体,转染DC并负载肿瘤抗原后制备成疫苗.观察各组脾脏T淋巴细胞IFN-γ和IL-4的分泌量以及DC诱导的CTLs对胰腺癌细胞的杀伤作用.结果:基因测序证实IL-23基因克隆及双表达载体构建成功,转染后DC对共刺激分子MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达增强.接种IL-23修饰DC疫苗后小鼠的免疫防御能力显著增强;DC介导的免疫应答促进了IFN-γ生成型Th1细胞的产生,IL-23转染组IFN-γ的分泌与其他各组比较差异显著(P＜0.01);IL-23转染组T细胞对抑制性细胞因子IL-4的分泌减少,与DC疫苗组和IL-23 DC组比较有显著差异(P＜0.05).转染的DC疫苗在体内诱导出高水平的CTLs活性(P＜0.05).结论:IL-23使DC抗原递呈能力更强,IL-23修饰DC疫苗可强化宿主针对特异肿瘤的CTLs免疫应答,使宿主不仅产生防御性免疫反应而且增强自动免疫能力.
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表达白介素-23基因的重组纯化及其对妊娠期哮喘气道炎症状态下免疫应答产生的影响
目的 研究IL-23融合基因免疫调节及其生物学功能与妊娠期哮喘气道炎症的相关性.方法用构建表达IL-23 p40+p19双亚基真核表达质粒转化E.coil BL21菌,IPTG诱导表达产物纯化后,通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法进行检测;荧光显微镜及Western blot法鉴定重组蛋白介导质粒转染结果,凝胶电泳迁移实验测定核蛋白的DNA结合活性变化;ELISA法、HE染色分析外源蛋白体内转移对小鼠血清炎性因子水平及肺组织炎症损伤影响;流式细胞术验证外周血单个核细胞中CD4+T细胞亚群比例.结果 成功获得可溶性重组外源蛋白可跨膜转运,并有效介导EGFP进入目标细胞,其稳定表达及转录活性均高于单纯质粒转染效应;GST/pCEP4-IL-23特异结合质粒DNA形成大分子复合体使凝胶迁移率降低;与LPS共同作用,明显增加致敏小鼠血清IL-17A含量(P＜0.05)和肺组织炎症病理反应程度;降低患者外周血IFN-γ、Foxp3水平,促进IL-4、IL-17A活化,进而升高Th2/Th1和Th17/Treg比值(P＜0.05).结论 重组IL-23蛋白具有致病性,参与妊娠哮喘炎症调控,CD4+T亚群免疫失衡共同对妊娠母体免疫耐受及疾病发生发展产生影响.
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IL-23基因修饰的树突细胞疫苗联合β-榄香烯对小鼠胰腺癌生长的影响
背景与目的:树突细胞(dendritic cells,DC)疫苗是目前具应用潜能的治疗性疫苗,功能性细胞因子能显著增强DC的活性及其诱导的宿主抗肿瘤作用,利用细胞因子基因修饰DC是当今肿瘤免疫治疗中活跃的领域.本研究探讨β-榄香烯联合白细胞介素-23(interleukin-23,IL-23)修饰的DC疫苗对胰腺癌小鼠的协同抗肿瘤作用.方法:克隆并构建IL-23基因真核双表达载体,转染DC并负载肿瘤抗原后制备成疫苗.将IL-23基因转染的DC疫苗、空质粒转染的DC疫苗、未转染的DC疫苗及对照生理盐水分别注射小鼠,体外观察各组小鼠脾脏T淋巴细胞IFN-γ及IL-4的分泌.体内观察β-榄香烯联合DC疫苗对荷胰腺癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及对小鼠存活期的影响.结果:基因测序证实IL-23基因克隆及双表达载体构建成功,转染后DC共刺激分子MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达增强.接种IL-23转染DC疫苗后小鼠的免疫防御能力显著增强,有效地延缓并防御接种肿瘤的发生.DC介导的免疫应答促进了IFN-γ生成型Th1细胞的产生,未转染DC疫苗组和空质粒转染DC疫苗组IL-4分泌量与IL-23转染的DC疫苗组比较差异有显著性(P＜0.05);IL-23转染DC疫苗组IFN-y的分泌与其他各组比较差异有显著性(P＜0.01).β-榄香烯联合IL-23转染DC疫苗组肿瘤生长受到显著抑制,该组小鼠存活期与DC组、NS对照组及β-榄香烯组比较差异有极显著性(P＜0.01).结论:IL-23修饰DC疫苗可强化宿主针对特异肿瘤的Th1及CTL的免疫应答,使宿主不仅产生防御性免疫反应而且增强自动免疫能力.β-榄香烯有一定的协同抗癌作用.
