061用表达hCGβ-嵌合分子的质粒进行DNA免疫接种

嵌合分子(DHT-PROTAC)在前列腺癌研究中的进展

前列腺癌多发于老年男性,已成为老年男性常见肿瘤之一.内分泌治疗目前是晚期前列腺癌主要治疗方法,但仍避免不了前列腺癌终进展成激素非依赖性前列腺癌,导致内分泌治疗的失败.当前,对前列腺癌细胞株的AR表达的研究,主要集中在DNA水平及mRNA水平,而对AR蛋白翻译后调控的研究较少.近些年来,嵌合分子(DHT-PROTAC)是基于蛋白水平,调控AR蛋白的表达,成为研究前列腺癌转归新的热点.DHT-PROTAC是一种新型人工合成的异型双功能小分子;这种小分子是DHT与泛素连接酶E3识别基团的嵌合体,它不仅能与AR结合,而且能在结合后,诱导AR的泛素化,从而通过泛素-蛋白酶途径降解AR;本文介绍了嵌合分子的作用原理,回顾了近些年前列腺癌的治疗进展,分析了嵌合分子将来在前列腺癌治疗中的应用前景.

雄激素非依赖性前列腺癌细胞雄激素受体靶向降解的实验研究

目的:研究合成的嵌合分子DHT-PROTAC通过泛索蛋白酶体途径对雄激素非依赖性前列腺癌C4-2B细胞表达雄激素受体(AR)的靶向降解作用,以及AR降解后该细胞分泌、增殖和凋亡的变化. 方法:实验细胞分3组:空白对照组(RPM1 1640培养液)、溶剂对照组[0.1%二甲基亚砜(DMSO)]及实验组(100 μmol/L DHT-PRO-TAC);制备细胞爬片,免疫组化和Western印迹检测CA-2B细胞中AR蛋白和Caspase-3表达情况的改变;ELISA法测定细胞培养液上清中PSA的浓度改变.噻唑兰(MTT)比色法检测细胞增殖抑制,细胞计数并绘制生长曲线观察细胞增殖能力. 结果:与空白对照组和溶剂对照组相比,DHT-PROTAC处理后,CA-2B细胞中表达的AR蛋白明显减少,Western印迹检测结果表现为信号减弱(P<0.06);免疫组化见AR阳性细胞明显减少,阳性率降低达40%;与空白对照组和溶剂对照组相比,DHT-PROTAC处理后细胞培养上清液中PSA浓度降低约60%(P<0.05).MIT试验显示随着DHT-PROTAC处理时间延长,对CA-2B细胞的抑制率逐渐增大,细胞生长呈时间依赖性抑制(P<0.05). 结论:嵌合分子DHT-PROTAC能靶向降解CA-2B细胞表达的AR,抑制细胞分泌PSA,并抑制该细胞的体外生长和增殖.

嵌合分子靶向降解鼻咽癌细胞表皮生长因子受体的实验研究

目的:检测合成的蛋白靶向嵌合分子(EGF-PROTAC)通过泛素-蛋白酶体途径体外对人鼻咽癌CNE-2细胞表皮生长因子受体(EGFR)靶向降解作用,并证实对该细胞增殖、凋亡的影响.方法:EGF-PROTACr处理细胞后,应用Western blot技术分析EGFR蛋白表达水平;CKK-8、流式细胞术、Transwell侵袭实验检测EGF-PROTAC对CNE-2产生的生物学效应.结果:Western blot技术显示EGF-PROTAC组EGFR蛋白的表达水平显著低于对照组(P＜0.05);CKK-8法显示EGF-PROTAC组3、6、9、12 h CNE-2细胞存活率显著低于溶剂对照组(P＜0.05);流式细胞术显示EGF-PROTAC组细胞凋亡指数显著高于对照组(P＜0.05);Transwell法显示EGF-PROTAC组CNE-2细胞侵袭到Transwell小窒滤膜下细胞数显著低于溶剂对照组(P＜0.05).结论:EGF-PROTAC能够靶向降解CNE-2细胞的EGFR,在体外能抑制鼻咽癌细胞的生长、促进凋亡.

可溶性嵌合补体抑制分子的构建及表达

目的制备能抑制补体活化的2个关键环节(C3/C5转化酶和MAC的形成)的一种新型、高效补体抑制剂.方法先设计引物,然后通过PCR技术扩增重组可溶性CD46/CD55/CD59嵌合分子cDNA片段,重组于pSecTagA真核表达载体上,分别利用COS-7细胞和中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞进行表达,并用抗人CD46多克隆抗体及抗人CD55、CD59单克隆抗体对表达产物进行westem blotting鉴定.结果 DNA测序证实,前端带有小鼠IgGk链前导序列,后端融合有编码6个组氨酸碱基的CD46/CD55/CD59嵌合分子cDNA片段的阅读框完整.免疫印迹结果显示,表达的重组蛋白分别能与抗入CD46多克隆抗体和抗人CD55、CD59单克隆抗体结合.结论成功构建并在真核细胞内表达了重组可溶性CD46/CD55/CD59嵌合分子,为进一步研制和开发新一代多功能、多靶点补体抑制剂奠定了基础.

GPI锚固型CD46/CD55嵌合分子的设计及构建

目的选取调控补体活化中心环节C3转化酶的两种膜调节蛋白CD46和CD55,设计构建了新型的GPI锚固型CD46/CD55嵌合分子.方法以CD46cDNA 和CD55cDNA 为模板,通过PCR及PCR重叠延伸技术(SOE)得到CD46/CD55嵌合cDNA.为避免双分子连接后的空间结构和功能的变化,在CD46与CD55之间引入了多肽氨基酸接头(Linker),然后克隆构建GPI锚固型CD46/CD55-Bluescript M13克隆载体.结果获得了阅读框完整、连接部位正确的GPI锚固型CD46/CD55嵌合分子cDNA.结论本研究为研制开发新一代的多功能、多靶点的补体抑制剂奠定了基础.