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氧化石墨烯纳米疫苗的免疫应答研究
目的 研究氧化石墨烯(GO)纳米疫苗在小鼠体内诱导产生的特异性免疫应答.方法 将纳米GO与模型抗原卵清蛋白(OVA)共孵育制备得到负载OVA的GO纳米免疫复合物(GO-OVA).采用原子力显微镜和粒度分析仪对纳米GO进行表征;细胞计数试剂盒(CCK-8)检测纳米GO对小鼠骨髓树突状细胞(BMDCs)的细胞毒性;荧光染色观察小鼠BMDCs对GO-OVA纳米免疫复合物的摄取.将C57BL/6小鼠按体质量随机区组法分为OVA组、铝佐剂OVA(Al-OVA)组和GO-OVA组(每组6只)进行体内免疫,酶联免疫吸附实验(ELISA)分别检测小鼠血清中OVA特异性抗体IgG(总IgG、IgG1和IgG2a)水平,流式细胞术检测小鼠脾脏和腹股沟淋巴结内的T淋巴细胞亚群.结果 制备得到的纳米GO平均粒径为(294.34±4.68)nm,多分散系数为0.208.纳米GO对小鼠BMDCs的毒性较小.体外细胞实验结果表明,GO-OVA纳米免疫复合物可被小鼠BMDCs有效摄取.GO-OVA纳米免疫复合物免疫小鼠后,诱导产生的血清特异性IgG 抗体滴度与铝佐剂相当,差异无统计学意义(P＞0.05),且以辅助性T细胞(Th)1型应答为主.GO-OVA组小鼠脾脏和腹股沟淋巴结内的CD4+T和CD8+T淋巴细胞比例均明显高于OVA组和A1-OVA组,差异均具有统计学意义(均P＜0.05).结论 GO-OVA纳米免疫复合物能诱导小鼠同时产生体液和细胞免疫应答,这为研制新型疫苗载体和佐剂提供了依据.
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PLGA为佐剂的螨变应原纳米疫苗治疗小鼠过敏性鼻炎研究
目的 探讨螨变应原Der p2经聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)包载合成的纳米疫苗特异性免疫治疗小鼠过敏性鼻炎的疗效及机制.方法 取雄性SPF级BALB/c小鼠30只,4～6周龄.随机分为5组,即正常组、模型组、空白PLGA治疗组、螨抗原纳米疫苗治疗组(PLGA-DP2治疗组)及螨重组蛋白Der p2治疗组,每组6只.按常规方法建立尘螨过敏性鼻炎小鼠动物模型.建模成功后,空白PLGA治疗组、PLGA-DP2治疗组和螨重组蛋白Der p2治疗组分别使用空PLGA、PLGA-Der p2纳米疫苗(含50 μg Der p2蛋白)和50μg螨重组蛋白Der p2经小鼠腹部皮下注射进行免疫治疗,每隔3d注射1次,共治疗5次.治疗结束后,取螨变应原粗浸液200 μg分别滴鼻激发小鼠,激发结束后处死小鼠.在小鼠激发后的30 min内,观察并记录各组小鼠鼻部症状(喷嚏次数、搔鼻及鼻分泌物量)评分情况;检测血清中过敏原特异性抗体(IgE)及细胞因子[白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10和γ干扰素(INF-γ)]水平;观察鼻黏膜组织形态学变化.结果 螨抗原纳米疫苗PLGA-DP2载药量13.6％,包封率88.4％;纳米粒直径为200～ 400 nm.治疗后小鼠鼻部症状评分,PLGA-DP2治疗组鼻痒(0.67±0.52)分,喷嚏(1.00±0.63)分,清涕(1.67±0.41)分;螨重组蛋白Der p2治疗组分别为(0.83±0.41)分、(1.50±0.55)分、(0.83±0.75)分.明显低于模型组,且PLGA-DP2治疗组降低更明显(P＜0.05).PLGA-DP2治疗组和螨重组蛋白Der p2治疗组与模型组比较,血清特异性IgE及IL-4水平方面均明显降低,PLGA-DP2治疗组降低更显著(P＜0.05);而IL-2、IL-10和INF-γ水平显著增加,PLGA-DP2治疗组增加更显著(P＜0.05).PLGA-DP2治疗组小鼠鼻黏膜病理表现,上皮细胞基本排列整齐,组织结构清晰,相对模型组黏膜下层嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等炎性细胞减少,鼻黏膜纤毛结构相对比较完整,黏膜基层肿大程度减轻;基本与正常组一致.结论 尘螨变应原纳米疫苗加以PLGA为佐剂可有效地抑制小鼠过敏性鼻炎的炎症反应,极大地提高了过敏原疫苗的疗效.
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胃癌特异性纳米疫苗的制备及其生物学活性的研究
目的: 以胃癌特异性多肽抗原MG7为靶点研制胃癌特异性纳米疫苗,并观察其对小鼠的免疫效能.方法: 人工合成胃癌MG7-Ag的模拟表位多肽,用磁力超声法将其包封于纳米乳剂中,通过透析纯化,HPLC检测其包封效率.用包封有MG7抗原肽的纳米疫苗免疫健康Balb/c小鼠,以空白纳米疫苗和PBS作为对照,测定其免疫活性,通过ELISA测定血清中抗MG7抗体的效价;ELISPOT测定小鼠脾CTL活性.同时,用表达MG7-Ag的小鼠艾氏腹水瘤细胞进行肿瘤攻击2周,观察疫苗对小鼠的保护作用.结果: 成功制备了胃癌MG7-Ag的纳米疫苗,并具有较好的包封率和较好的稳定性,小鼠产生MG7抗体, ELISPOT检测包封组与对照组相比分泌IFN-γ的活性淋巴细胞数量明显增高.疫苗免疫组8只小鼠中有2只未见肿瘤形成, 而对照组8只小鼠则全部成瘤.结论: 胃癌MG7-Ag表位纳米疫苗具有免疫原性,可以诱导小鼠产生抗肿瘤免疫.
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PLGA-HPV16mE7纳米疫苗抗HPV16免疫反应的研究
目的:探讨生物可降解材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为载体负载突变后的高危型人乳头瘤病毒16E7(HPV16E7)蛋白的纳米疫苗诱抗肿瘤的免疫反应.方法:表达并纯化定点突变的HPV 16 E7蛋白(HPV16mE7).表征用复乳溶剂挥发法制备的HPV 16mE7/PLGA纳米粒.HPV 16mE7/PLGA纳米粒皮下免疫C57BL/6(H-2b)小鼠2次,用ELISA检测血清中的抗HPV 16E7抗体水平,用Elispot和用乳酸脱氢酶(LDH)释放实验分别检测产生IFN-γ和CTL反应.结果:Western Blot分析证明HPV 16mE7蛋白具有和野生型HPV 16E7诱导产生的抗体结合的活性.HPV 16mE7/PLGA纳米粒粒径大小为(335.6±6.32)nnm,Zeta电位为(-6.9±0.41)mV,包封率为62.4％,体外释放呈双相动力学特征,于第9天累积释放达58.2％,纳米悬液在4℃至少稳定1个月.HPV 16mE7/PLGA纳米粒免疫的小鼠血清抗E7抗体水平、CTL和产生IFN-γ细胞显著高于HPV 16mE7免疫组的小鼠.结论:HPV16mE7/PLGA纳米疫苗具有较单纯的HPV16mE7诱导小鼠产生更强的体液和细胞免疫反应.HPV16mE7/PLGA纳米疫苗可作为HPV16感染相关疾病候选疫苗.
关键词： 人类乳头状病毒16 纳米疫苗 聚乳酸-羟基乙酸共聚物 -
男性避孕纳米粒的制备与体外实验研究
目的 构建聚乳酸-羟乙酸共聚物(polylactic acid-glycolic acid,PLGA)包载促卵泡生成素受体表位肽(FSHR32-44)的纳米粒,探讨PLGA材料作为避孕疫苗载体的可行性.方法 使用PLGA为载体,制备出包载促卵泡生成素受体的B细胞表位(FSHR32-44)的纳米粒,透射电镜(TEM)观察表观形态,粒径仪检测粒径分布范围和Zeta电位,体外释放试验检测其理化特性.激光共聚焦显微镜观察小鼠骨髓来源树突状细胞(DCs)吞噬FSHR可溶性多肽和FSHR/PLGA NP的能力,流式细胞仪检测FSHR、PLGA NP和FSHR/PLGA NP促骨髓来源DCs成熟能力.结果 单乳-溶剂挥发法制备的FSHR/PLGA NP大小粒径分布均匀、表面规整,粒径(296.3±3.5)nm,Zeta电位(-16.1±0.4)mV,FSHR包封率(62.71±2.83)％,并具有缓慢释放抗原的能力;体外细胞水平实验结果显示FSHR表位肽纳米粒易于被DCs摄取,有剂量和时间依赖性,能显著上调DCs表面CD40、CD86、CD83和MHC-Ⅱ功能分子的表达.结论 PLGA包载FSHR多肽有良好的包封率,易被DCs吞噬,并有强的促进DCs成熟作用,可以作为FSHR32-44避孕疫苗的载体.
