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可诱导的慢病毒文献资料
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慢病毒Tet-On系统调控Notch1-EGFP融合蛋白在PC12细胞中表达的研究
目的:构建Tet-On系统调控的人源性Notch1胞内段(NICD)和EGFP融合蛋白的慢病毒真核表达载体,并探讨Notch1-EGFP在PC12细胞中的表达条件.方法:采用RT-PCR从人胎盘组织中获得NICD的cDNA,利用PCR扩增pEGFP-Cl质粒中EGFP的编码序列,两者均定向克隆到pcDNA3.1(+)质粒中组成Notch1-EGFP片段,将该片段进一步酶切回收,并定向克隆到pLVX-Tight-puro载体获得pLVX-Notch1-EGFP.将构建好的质粒进行病毒包装并感染PC12细胞,抗性筛选2周.在不同时间点和不同浓度Dox作用下,用荧光显微镜观察EGFP表达,流式细胞术检测Notch1表达.结果:酶切和DNA测序均证实pLVX-Notch1-EGFP质粒构建成功.镜下可见感染后的PC12细胞在500 ng/ml Dox诱导36 h时90％以上细胞均表达EGFP.流式细胞术检测Notch1表达结果显示,随着Dox浓度增加,Notch1阳性细胞百分比逐渐增加；随着Dox诱导时间延长,Notch1阳性细胞百分比逐渐增高,到36h时达到高(81.5％).结论:成功构建携带Notch1-EGFP融合蛋白的Tet-On调控的慢病毒真核表达载体,实现在PC12细胞中调控Notch1-EGFP融合蛋白的表达.
