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膜突蛋白磷酸化在大鼠肺微血管内皮细胞损伤中的作用机制探讨
目的 观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)损伤中膜突蛋白(Moesin)磷酸化水平的变化,探讨Rac1信号通路对Moesin磷酸化的影响.方法 体外培养大鼠PMVECs并传至第3代,分别进行TNF-α时效实验、量效实验以及Rac1信号通路干预实验.① 时效实验:以10μg/L TNF-α分别刺激大鼠PMVECs 0、15、30 min和1、3、6、12 h后,采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测Moesin和磷酸化Moesin(p-Moesin)的蛋白表达.② 量效实验:分别以0、0.1、1、10μg/L TNF-α刺激大鼠PMVECs 6 h后,采用Western Blot检测Moesin和p-Moesin的蛋白表达.③Rac1信号通路干预实验:在PMVECs细胞中分别给予3 mL 200μmol/L的Rac1特异性抑制剂NSC23766预孵0.5 h或200μmol/L的Rac1特异性激动剂O-Me-cAMP预孵1 h,再分别与10μg/L的TNF-α共孵育6 h;同时设立空白对照组及O-Me-cAMP、NSC23766、TNF-α单独处理组;采用Western Blot检测Moesin和p-Moesin的蛋白表达.结果 ① 时效实验结果:以10μg/L TNF-α与大鼠PMVECs共孵育后各时间点Moesin表达量无明显变化;而TNF-α诱导15 min时,p-Moesin表达量即较0 min迅速升高(p-Moesin/Moesin:4.399±0.523比1.000±0.195),30 min达高峰(6.069±0.557),1 h后逐渐下降(1、3、6、12 h分别为5.005±0.544、4.599±0.478、1.742±0.288、1.503±0.352),各时间点间差异有统计学意义(F=15.397,P=0.002).② 量效实验结果:各剂量TNF-α与大鼠PMVECs共孵育6 h时Moesin表达量无明显变化;而以0.1μg/L TNF-α诱导的p-Moesin表达量即较0μg/L显著升高(p-Moesin/Moesin:2.194±0.430比1.000±0.273),且随TNF-α剂量增加呈持续升高趋势(1μg/L和10μg/L分别为3.201±0.688、4.413±0.296),各剂量组间差异有统计学意义(F=92.513,P<0.001).③Rac1信号通路干预实验结果:各组间Moesin表达量无明显差异.与空白对照组比较,Rac1特异性激动剂O-Me-cAMP或Rac1特异性抑制剂NSC23766单独刺激均不能改变p-Moesin表达;而TNF-α可诱导p-Moesin表达.与TNF-α组比较,NSC23766可显著上调TNF-α诱导的p-Moesin表达(p-Moesin/Moesin:2.612±0.355比1.911±0.297,P<0.05);而O-Me-cAMP则呈现显著下调作用(p-Moesin/Moesin:1.928±0.331比3.030±0.353,P<0.05).结论 Moesin的磷酸化参与了TNF-α诱导的大鼠PMVECs损伤;通过调控Rac1信号通路中的Moesin磷酸化表达可以减轻PMVECs损伤.
