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过量氟对大鼠切牙釉丛蛋白表达的影响
目的 研究过量氟对大鼠切牙发育过程中釉丛蛋白表达的影响,探讨氟斑牙的发病机制.方法 选择20只Wistar大鼠,随机分成两组:对照组(蒸馏水组)和实验组(100mg/L F- ).复制大鼠氟斑牙模型.饲养8周处死动物,利用免疫组化和实时荧光定量PCR (Real-Time PCR)方法观察过量氟对大鼠切牙中釉丛蛋白表达的影响.结果 免疫组化结果显示釉丛蛋白在分泌前期和分泌期的成釉细胞中呈阳性表达.实验组釉丛蛋白的表达明显弱于对照组,存在显著性差异(P＜0.01).Real-Time PCR结果显示釉丛蛋白mRNA在对照组表达明显高于在实验组表达水平(P＜0.01).结论 过量氟可能通过抑制釉丛蛋白的表达,从而影响釉质的矿化,导致釉质发育障碍.
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小鼠釉丛蛋白基因不同mRNA剪接体的克隆
目的:克隆小鼠釉丛蛋白基因不同mRNA剪接体,分析小鼠釉丛蛋白的多态性.方法:采用异硫酸氰胍一步法从新生小鼠磨牙牙胚组织中提取总RNA,反转录成cDNA第一链,经PCR扩增出小鼠釉丛蛋白基因特异片段,插入pBS质粒,筛选阳性克隆,并经酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆.结果:克隆T1序列与已发表的完整釉丛蛋白mRNA序列一致.克隆T2序列与完整釉丛蛋白mRNA序列比较,缺失序列的84～158的75个碱基片段.结论:小鼠釉丛蛋白基因在转录mRNA时,可产生不同的剪接体.
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小鼠釉丛蛋白在大肠杆菌中的表达,纯化及抗血清的制备
目的:以大肠杆菌为工程菌制备釉丛蛋白,纯化并免疫制备抗血清.方法:用酶切、连接的方法将已克隆至pBluescript KS+载体中的Tuftelin cDNA片段(编码365个氨基酸)用T4 DNA连接酶连入载体pPRoEXTMHTc中,转化大肠杆菌,IPTG 诱导.收集菌体,裂解后SDS-PAGE 电泳,表达出分子量Mr 42×103的融合蛋白.割胶后免疫新西兰大白兔,制备抗体.结果:表达出分子量Mr 42×103的融合蛋白与预期一致.8周以后,Western检测抗原抗体特异性及抗体效价达1:100 000.结论:认为成功的表达出釉丛蛋白并制备出了高效价多克隆抗体.
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小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区cDNA克隆
目的:克隆小鼠釉丛蛋白(tuftelin)成熟肽编码区基因.方法:设计引物,以小鼠牙胚cDNA文库为模板,利用PCR方法,扩增出小鼠釉丛蛋白成熟区的基因片段(约1200bp) ,将所得基因片段插入pBS质粒载体,转化到大肠杆菌XL-1-Blue后挑选阳性克隆,提取重组质粒DNA,通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析鉴定阳性克隆.结果:重组质粒pBS-tuftelin的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致.结论:克隆到小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区基因.
