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应用SEFA-PCR扩增刺五加内生青霉鲨烯合酶基因的旁邻序列
①目的 克隆刺五加内生青霉Penicillium minioluteum P116-1a鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的旁邻序列.②方法 根据已经获得的P.minioluteum P116-1a SS DNA序列设计特异性性引物,采用SEFA-PCR(self-formed adaptor PCR)扩增其3'和5'末端未知序列.③结果 3'末端扩增获得长约5 000 bp的片段,5'末端扩增获得长约3 000bp的片段.④结论 首次应用SEFA-PCR技术扩增获得P.minioluteum P116-1a SS基因的末端序列,为进一步研究该基因对刺五加皂苷含量的作用机制奠定了基础.
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川泽泻鲨烯合酶基因的原核表达研究
目的:构建川泽泻鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的原核表达载体.方法:在建泽泻SS基因序列的基础上,采用RT-PCR技术,从川泽泻新鲜叶片中克隆得到SS基因,并在BL21(DE3)细胞中分别用不同的表达载体、IPTG浓度、温度诱导该蛋白表达.结果:该基因在大肠杆菌中表达,但为包涵体,将其克隆到带有GST标签的pGEX-6t-1载体中进行原核表达并未改善蛋白溶解性;30℃诱导蛋白表达佳;不同IPTG浓度对蛋白表达影响不大.结论:川泽泻的原核表达为后续对该基因的生物学功能及川泽泻品质改良奠定了基础.
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青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA的克隆与测序
[目的]克隆青蒿鲨烯合酶基因,为基因工程改造青蒿打下基础.[方法]采用聚合酶链反应(PCR)扩增、逆转录聚合酶链反应(RT PCR)扩增、扩增片段与T 载体连接和克隆片段的序列分析等方法.[结果] 通过PCR扩增和RT PCR扩增,分别获得3590bp及1257bp片段,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定.初步测序结果与GenBank上已登录的青蒿鲨烯合酶基因序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为100%.[结论]成功克隆了青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA.
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啤酒酵母鲨烯合酶基因的克隆及其基因表达载体的构建
[目的] 克隆啤酒酵母鲨烯合酶基因及构建其基因表达载体,为在微生物体内重建青蒿素合成途径打下基础.[方法]采用聚合酶链反应(PCR)扩增、扩增片段与T-载体连接和克隆片段的序列分析;酶切并回收目的基因,反向插入酵母表达载体pGAPZαA,双酶切鉴定重组子.[结果] 通过PCR扩增获得1 335 bp片段,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定.初步测序结果与GenBank上已登录的酵母鲨烯合酶基因序列基本吻合,相差仅数个碱基对;将此片段反向插入酵母表达载体pGAPZαA,构建了反义酵母表达载体,并通过双酶切加以鉴定.[结论] 成功克隆了啤酒酵母鲨烯合酶基因并进行了测序,同时构建了反义酵母表达载体.
