转基因动物研究开发概况
摘要： 当今世界各国转基因动物研究发展迅速,其目的是:一方面是培育生长快、体大、瘦肉型、高产的优良动物新品种;另一方面是以转基因动物作为生物反应器生产贵重药品及精细化工产品.但是进行转基因动物研究必需要有高质量的实验动物,否则,研究转基因动物无从谈起.为此,拟将近年来国内外转基因动物研究与开发情况加以介绍.
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比格犬雌激素受体ERβ以及剪切异构体ERβ419、ERβ431的转录活性分析
目的 分析比格犬雌激素受体ERβ以及剪切异构体ERβ419、ERβ431的转录活性.方法 将细胞分为6组,空白对照组(正常含有培养液的293T细胞),LV5-ERβ组(稳定表达ERβ的293T细胞),LV5-NC组(感染慢病毒LV5空载体的293T细胞),Lenti-OE-Flag-ERβ431组(稳定表达ERβ431的293T细胞),Lenti-OE-Flag-ERβ419组(稳定表达ERββ419的293T细胞),Lenti-OE-Flag-ERβ419-NC组(感染慢病毒Lenti-OE-Flag空载体的293T细胞).其中每组组内又分为2组,每组细胞瞬时转染构建的重组质粒ERE-LUC和RLUC,每组中的其中一组加入终浓度为10μmol/L的E2,而另一组内加入等量无水乙醇.分别检测每组加入刺激(E2和无水乙醇)前后的荧光素酶活性.结果 成功地将雌激素反应元件ERE克隆到荧光素酶报告载体pGL3-Vector启动子上;设计引物扩增出的hRluc-neo基因成功克隆到pGL3-Basic载体;加入雌激素后,比格犬ERβ转录活性明显升高(P＜0.01),而ERβ419和ERβ431转录活性在雌激素加入前后变化不大(P＞0.05).结论 成功建立了比格犬ERβ的转录激活系统,而ERβ419和ERβ431的LBD区域都有部分的缺失,使得其不能与雌激素结合,继而转录活性无法被激活.
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15-KETE对大鼠肺动脉平滑肌细胞Kv1.5、Kv2.1表达的影响
目的 从细胞分子水平研究电压门控型钾通道亚型Kv1.5、Kv2.1在15-酮基二十碳四烯酸(15-ketoeicosatetretraenoic acid,15-KETE)致大鼠肺动脉收缩过程中的作用.方法 通过酶法分离、培养SD大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth cells,PASMCs),使用RT-PCR和Western blot技术观察15-KETE对大鼠PASMCs上Kv1.5、Kv2.1通道表达的影响.结果 (1)15-KETE下调大鼠PASMCs膜上Kv1.5通道mRNA及蛋白质的表达;(2) 15-KETE下调大鼠PASMCs膜上Kv2.1通道mRNA及蛋白质的表达.结论 Kv1.5、Kv2.1通道参与由15-KETE引起的缺氧肺动脉收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction,HPV).
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姜黄素对沙漠干热环境中暑大鼠生命体征和相关血液指标的影响
目的 探讨姜黄素对沙漠干热环境中暑生命体征和相关血液指标的影响,以阐明姜黄素对中暑大鼠的保护作用.方法 选取6～8周龄SPF级雄性SD大鼠200只,每组40只,随机分组(对照组、溶剂组、姜黄素低剂量预处理组、姜黄素中剂量预处理组、姜黄素高剂量预处理组),各组连续7d等体积灌胃,同时置于西北特殊环境人工实验舱中,设定沙漠干热环境气候模式(温度41℃,湿度10％),分别在0 min、50 min、100 min、150 min时间点,各组随机取10只动物测量核心体温、称质量、并出舱麻醉,采集动脉、静脉血,测定血气、血常规及血生化指标.结果高剂量组10 min体温平均上升速率明显低于对照组(P＜0.05)和溶剂组(P＜0.05);高剂量组10 min体质量平均下降速率明显低于对照组(P＜0.05)、溶剂组(P＜0.05);高剂量组10 min体质量平均下降速率与pO2、pH值、糖、甘油三酯呈负相关(相关系数分别为:-0.955、-0.355、-0.692、-0.733),与白细胞数目呈正相关(相关系数为:0.943).结论 中暑大鼠的体温上升速率和体质量下降速率可能是反映大鼠预后的有用指标,姜黄素可以降低沙漠干热环境中暑大鼠体质量平均下降速率和体温平均上升速率,从而保持血液中较高的pO2、减缓血液pH值降低、维持血液中糖、甘油三酯能量物质在较高水平,同时抑制血液中白细胞数目上升,从而可能通过维持机体内环境的相对稳定而发挥对沙漠干热环境中暑大鼠损伤的保护作用.
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三种检测BALB/c小鼠受孕方法的比较研究
目的 对三种不同的检测BALB/c小鼠是否受孕的方法进行比较研究.方法 只检测阴栓(方法一)、检测阴栓结合称量体质量(方法二)、只称量体质量(方法三),用3种方法检测同一组雌鼠的受孕情况并比较各方法的检测能力.结果 方法一检测小鼠受孕的灵敏度为0.71、特异度为0.47,方法二灵敏度为0.71、特异度为0.94,方法三灵敏度为0.96、特异度为0.94.结论 在对受孕(gestation day,GD)10天及后期孕鼠的检测方法中,称量体质量较其它方法更为可靠和实用.
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Gln对鸭瘟感染鸭十二指肠免疫调节相关基因表达量的影响
目的 为谷氨酰胺(Glutamine,Gln)在正常鸭及鸭瘟(Duck plague,DP)模型中对肠道功能及作用途径的研究提供依据.方法 280只无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)7日龄雏鸭随机分为8组,四组梯度剂量每天灌喂Gln(0、0.5、1、2 g/kg饲料)6d,及另四组灌喂同等梯度剂量Gln 6 d,于第一天灌喂30 min后攻0.2 mL2000TCID50鸭瘟病毒,观察Gln对正常雏鸭的免疫促进作用及攻毒鸭免疫应激的缓解作用.测定Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)通路基因表达量.结果 Gln显著提高正常组TLR4通路mRNA表达量(P＜0.05),显著降低攻毒组表达量(P＜0.05).结论 Gln通过TLR4通路提高正常雏鸭肠道的免疫力,降低鸭瘟病毒(Duckplague virus,DPV)造成的肠道免疫损伤.
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SV40LT基因过表达慢病毒载体的构建与包装
目的 构建SV40LT基因过表达慢病毒载体,并对其进行慢病毒包装,为建立永生化的uncv小鼠胚胎成纤维细胞奠定基础.方法 从293T细胞中获得SV40LT基因,将其克隆到pLenti-GFP质粒中,构建重组穿梭质粒pLenti-GFP-SV40LT,测序鉴定后分别将鉴定的阳性pLenti-GFP-SV40LT和包装质粒pMD2.0G和psPAX2共转染293T细胞,包装产生慢病毒.结果 SV40LT基因过表达慢病毒载体的构建与包装成功.结论 SV40LT基因过表达慢病毒载体构建与包装的成功为uncV小鼠胚胎成纤维细胞的永生化提供了工具.
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建立快速检测禽白血病病毒的液相芯片方法
目的 建立快速检测禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)的液相芯片方法,为大量样品的检测提供技术支撑.方法 制备抗ALV P27单克隆抗体,生物素标记抗体,磁珠偶联捕获抗体,利用Luminex200分析系统验证该方法的特异性、敏感性及重复性.结果 阳性判定标准定为大于或等于空白对照的两倍.特异性检测结果显示与鸡的其他多种病原不存在交叉反应,特异性良好.同时多批次实验结果显示其变异系数在7％以内,说明该方法的稳定性好,可重复.结论 建立的检测ALV病原的液相芯片方法特异性好,稳定且可重复.
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血红素加氧酶-1基因敲除小鼠的饲养和鉴定
目的 繁殖并鉴定HO-1基因敲除(HO-1-/-)小鼠.方法 将引进的HO-1基因敲除杂合子小鼠,进行SPF级饲养,与C57BL/6野生型小鼠配种繁殖,提取子代小鼠的基因组DNA,PCR法特异性扩增HO-1基因片段,使用双脱氧测序法测得基因序列.子代小鼠出现3种基因型:野生型、杂合子型及纯合子型.杂合子小鼠进一步配种繁殖,以获得更多的基因敲除纯合子小鼠,纯合子小鼠用以课题研究.结果 HO-1基因敲除杂合子小鼠的饲养和繁殖均获得成功,获得了HO-1基因敲除纯合子和杂合子小鼠.结论 正确的饲养繁殖及鉴定方法是从HO-1基因敲除杂合子小鼠中获得纯合子小鼠的有效途径.
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2014年春季北京地区啮齿类实验动物健康状况的病理学调查和分析
目的 2014年5月本实验室对北京市14家单位的啮齿类实验动物的健康状况进行病理学调查.方法 采集啮齿类实验动物的心、肝、脾、肺、肾、大肠和小肠后经10％福尔马林固定,通过石蜡切片H.E.染色、冰冻切片油红O染色、PAS染色于显微镜下观察.结果 绝大多数实验用鼠为健康状态,仅部分非健康动物出现不同程度的肝细胞肿胀(32.6％)、轻度肺脏病变(24％)、肾脏蛋白样渗出物和管型(13.2％).本次抽检结果与前两年抽检结果相比较,肝脏脂肪染色阳性率(6.2％)低于2013年春秋季的17.1％和6.25％,以及2012年春秋季的26.7％和14.8％,有降低的趋势.值得引起注意的是,肾脏病变从2010年春季在小鼠(2％)和2011年春季在大鼠(20％)中偶发,发展至今,已经在小鼠(6％)、大鼠(12％)和豚鼠(20％)中普遍存在,从偶发病变发展成为常发病变,应加强防范.结论 本次调查结果表明北京地区啮齿类实验动物基本为健康状态,少数动物出现组织病理学变化可能与饲养环境、饲料营养成分以及运输、处死时的应激有关,宜提高饲养管理水平和避免应激来加以改善.
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黄精多糖对急性心肌梗死模型大鼠炎症及氧化应激反应的影响
目的 探讨黄精多糖(PSP)对急性心肌梗死模型(AMI)大鼠损伤的保护作用及可能机制.方法 采用结扎冠状动脉左前降支的方法制备心肌梗死动物模型,假手术组只穿线不结扎,将造模成功的大鼠随机分为模型组、黄精多糖高、中、低剂量组(900 mg/kg、450 mg/kg、225 mg/kg)及阳性组(麝香保心丸,12.2 mg/kg·d),每组10只,每日灌胃1次,连续4周.分别记录造模前、造模即刻及给药1、3、7、10、14、21、28 d心电图S-T段变化,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组大鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-0)、白介素6(IL-6)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(M DA)含量;显微镜下观察受损心肌病理学的改变.结果 与模型组相比,黄精多糖能明显抑制心肌梗死模型大鼠S-T段的升高;各给药组大鼠血清IL-6、TNF-0水平均显著降低(P＜0.05或0.01),GSH-Px活性升高(P＜ 0.05或0.01),并降低MDA含量(P＜0.05或0.01),心肌损伤程度明显改善.结论 PSP对急性心肌梗死模型大鼠心肌损伤有保护作用,其作用机制可能与减轻炎症反应,提高氧自由基清除能力,减少脂质过氧化损伤有关.
