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葡萄胎的恶性潜能
葡萄胎,又称水泡状胎块,是一组良性妊娠滋养细胞病变,以构成绒毛的滋养细胞不同程度的增生及绒毛间质水肿为主要病理特点,大体标本为成串大小不同之水泡构成葡萄样外观,局限于子宫腔内.世界卫生组织分类中将其列为良性滋养细胞疾病.葡萄胎分为完全性及部分性两种,前者全部绒毛水肿变性,中轴血管消失,胎儿及附属物不见,后者仅为部分绒毛水肿变性,中轴血管尚存且可见胎儿有核红细胞,胎儿及附属物同时并存.
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孕妇外周血中胎儿细胞及胎儿DNA的检测
目的建立从孕妇外周血中分离有核红细胞(NRBC)及DNA的可靠方法,并鉴定其来源.方法对88例孕妇外周血分别通过密度梯度离心法,流式细胞术(FCM)和荧光激活细胞分离技术(FACS)分离NRBCs.应用套式PCR技术对65例孕妇血浆DNA进行正常男性SRY基因检测.结果①NRBCs:27例样品经密度梯度离心,其中14例分选到1～10个NRBCs.FACS技术对61例样品进行转铁蛋白受体阳性细胞(CD71+)分选,所有样品均有CD71+细胞,其浓度为(0.35±0.25)×10-2.②胎儿DNA:46例怀男胎孕妇血浆DNA中SRY基因检测出率为65.22%(30/46),怀女胎的19例样品SRY基因未检出率为94.74%(18/19).结论从孕妇外周血中分选胎儿NRBCs和血浆中胎儿DNA的方法已取得较大进展.利用母血中胎儿细胞及DNA诊断遗传性疾病可望成为佳非创伤性产前诊断技术.
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磁性纳米复合粒子富集胎儿细胞在无创性产前诊断22q11.2微缺失综合征中的应用
目的 探讨利用磁性纳米复合粒子富集胎儿细胞进行无创性产前诊断22q11.2微缺失综合征的可行性.方法 收集研究对象26例,分别经过磁性纳米粒子富集胎儿有核红细胞(研究组)及羊水穿刺胎儿细胞(对照组)进行荧光原位杂交(FISH)检测确定22q11.2是否存在异常,比较两组之间存在的差异.结果 两组在诊断22q11.2微缺失综合征方面一致率为100%(2/2),证实了利用该方法实现无创性产前诊断22q11.2微缺失综合征的可行性.结论 磁性纳米复合粒子富集胎儿细胞诊断22q11.2微缺失综合征为无创性的产前诊断,检测过程快速、准确、高效,较羊水穿刺胎儿细胞进行荧光原位杂交法具有无创及省力等优点,可望用于产前诊断22q11.2微缺失综合征,是一种值得推广的方法.
关键词： 磁性纳米粒子 胎儿有核红细胞 22q11.2微缺失综合征 产前诊断 -
孕妇外周血中胎儿有核红细胞的富集与纯化及其在非侵入性产前诊断中的应用
分子生物学技术已证实孕妇外周血中主要存在4种胎儿细胞,即:滋养层细胞、粒细胞、淋巴细胞和有核红细胞.适于富集纯化的是胎儿有核红细胞(NRBCs).应用密度梯度离心和流式细胞技术已能分选出该类细胞,并成功地应用于产前诊断胎儿性别及非整倍体疾病.
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孕妇外周血中的胎儿有核红细胞在非损伤性产前诊断中的研究进展
20世纪70年代以来,研究人员开始探索分离孕妇外周血中胎儿细胞的方法来进行非损伤性产前诊断.本文对用于非损伤性产前诊断的佳候选细胞-胎儿有核红细胞的特点、分离方法、培养、临床应用等方面的研究进展作一综述.
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影响孕妇外周血胎儿细胞体外培养的因素
一个世纪以前人们就发现孕妇外周血中存在胎儿细胞。分离、富集孕妇外周血中的胎儿细胞可用以对胎儿进行产前基因诊断。但这一理想的非损伤性产前诊断技术存在两大问题：①孕妇外周血中胎儿细胞极少；②富集得到的胎儿细胞纯度不高。人们尝试用各种各样的方法来克服这两大难点，其中孕妇外周血中的胎儿细胞的克隆化培养无疑是解决这两个问题的佳方法。
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利用孕妇外周血中单个胎儿有核红细胞进行产前基因分析
目的:从孕妇外周血中分选单个胎儿有核红细胞进行胎儿性别诊断,探讨胎儿单个有核红细胞在产前诊断中应用的可能性.方法:取50例孕妇外周血行密度梯度离心,将分离后的细胞制片,显微操作获取单个胎儿有核红细胞,进行巢式PCR扩增SRY基因,以确定其来源于胎儿,进行性别诊断.结果:单细胞的探测率为90%(45/50),性别总符合率(出生后胎儿性别与SRY基因扩增性别一致)为93.3%(42/45).结论:单个胎儿有核红细胞可应用于无创伤性产前基因诊断.
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联合干预离子通道提高PVDF膜富集胎儿有核红细胞的效率
目的 通过干预细胞膜阴离子通道(AE)和Na~+/K~+/2Cl~-离子共转运体(NKCC),提高聚偏二氟乙烯(PVDF)膜富集脐血有核红细胞(NRBC)的效率.方法 以密度为1.067的分离液分离NRBC,用AE抑制剂维拉帕米(verapamil)和NKCC抑制剂呋噻米(furosemide)联合干预,用流式细胞技术和巢式PCR观察干预前后离心法和过5 μm孔径PVDF膜法富集NRBC的效率.结果 佳离心分离密度梯度为1.067.流式细胞仪检测离心分离的NRBC平均纯度为2.54%,干预后离心分离NRBC纯度为9.36%,NRBC富集率提升近3.7倍;过PVDF膜前NRBC为0.83%,过膜后NRBC为6.15%,干预后过膜将NRBC富集率提升了7.4倍.用巢式PCR检测.每ml血样中NRBC为120个时,干预后过膜的扩增条带的密度值由4.48升高至17.78,提升近4倍.结论 维拉帕米和呋噻米能够通过改变脐血细胞性状,提高NRBC通过PVDF膜的效率.
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密度梯度离心结合Keihuaer抗酸染色法富集孕妇外周血中FNRBC的研究
目的 探索建立一种简便、快速、较低成本的用于孕妇外周血胎儿有核红细胞(FNRBC)富集的实验方法.方法 采集18名孕周在8～16周的孕妇外周血10 ml,经Percoll不连续密度梯度离心初步分离后,运用Keihuaer抗酸染色法对玻片上的细胞进行染色标记,显微镜下观察、辨别FNRBC的特殊染色及形态,对阳性涂片者进一步行胎儿血红蛋白(HBF)特异性抗体标记以证实其胎源性.结果 经Keihuaer抗酸染色处理,阳性FNRBC的胞浆染色呈深红色,核蓝色,而母亲的有核红细胞胞浆不着色.18名孕妇外周血中有14名可检出FNRBC,平均1～6个阳性FNRBC/病例,阳性检出率为77.8%.14例FNRBC阳性玻片经HBF抗体标记亦证实相同结果,而4例Keihuaer抗酸染色阴性病例亦表现HBF标记阴性,两者检出符合率100.0%.结论 密度梯度离心结合Keihuaer抗酸染色法用于富集FNRBC 具有较高的特异性,实验操作方法简便、快速,有望用于无创性产前基因诊断的推广应用.
关键词： 密度梯度离心 胎儿有核红细胞 Keihuaer抗酸染色 胎儿血红蛋白 -
孕妇外周血胎儿有核红细胞富集的孕周选择
目的 利用抗转铁蛋白受体(CD71)抗体和抗白细胞共同抗原(CD45)抗体双标法,检测不同孕周孕妇外周血中有核红细胞的比例,以期选择佳孕周进行胎儿有核红细胞富集.方法 采用抗-CD71抗体和抗 -CD45抗体双标法,应用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测81例不同孕周孕妇外周血中有核红细胞的比例,并与未孕组和脐血组进行对照.结果 孕7～34周孕妇外周血中CD71+/CD45dim细胞的比例为(0.107±0.063)×10-2,与未孕组和脐血组相比差异均有统计学意义;CD71+/CD4 5dim细胞在外周血中的比例在孕17～18周达峰值,为(0.144±0.096)×10-2.结论 不同孕周孕妇外周血有核红细胞比例不同,孕17～18周比例高.利用母血循环中的胎儿有核红细胞进行产前诊断,其佳时间可选择在妊娠17～18周.
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应用密度梯度离心结合免疫磁珠法富集孕妇外周血中胎儿NRBC的实验研究
目的 研究利用不连续密度梯度离心结合免疫磁珠方法,分选孕妇外周血中的胎儿有核红细胞(NRBC).方法 采集21名孕周在12-28周的孕妇外周血10ml,经不连续密度梯度离心后,再用免疫磁珠法分选和富集胎儿NRBC,同时对富集前后的孕妇外周血进行瑞氏染色和胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,HbF)特异性抗体标记、识别.结果 未经分选、富集,21名孕妇外周血有核细胞层涂片经瑞氏染色检查均未发现NRBC;梯度离心富集后21名孕妇中有11例外周血有核细胞涂片找到1～8个NRBC;再经免疫磁珠分离后有12例涂片发现1～7个NRBC,同时进行HbF特异性抗体标记,证实其NRBC阳性涂片中均存在胎源性NRBC.结论 本研究初步建立了分选、富集胎儿NRBC的实验方法,通过进一步的方法学改进,有望用于产前基因筛查的研究.
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孕妇外周血中胎儿有核红细胞的富集
目的:从孕妇外周血中分选富集出胎儿有核红细胞,以便用于无创伤性产前诊断.方法从32例孕11～20周的孕妇血中用Histopaque-1077密度梯度离心富集以及流式细胞仪计数出胎儿有核红细胞,并用喹吖因荧光染色检测Y-染色体以及用PCR检测Y-染色体DNA特异序列.结果流式细胞仪计数,每毫升孕妇外周血中计数到0.93×103～8.11×103个GPA阳性细胞;PCR结果与产后性别证实,符合率为90.06%.结论孕妇外周血中的胎儿有核红细胞经密度梯度离心和流式细胞仪分离后,可得到一定程度的富集和纯化,11～20周内FNRBCs数与孕期似无相关性,为非创伤性产前诊断提供实验数据与方法基础.
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孕妇外周血胎儿有核红细胞计数变化及其在不良妊娠结局预测中的应用
目的：观察孕妇外周血胎儿有核红细胞计数的变化,探讨其在妊娠不良结局预测中的应用价值。方法收集87例孕12~18周孕妇的外周血,密度梯度离心法分离单个核细胞,采用PE-GPA /FITC-CD71单克隆抗体双色标记胎儿有核红细胞后进行流式细胞分析,追踪妊娠结局并进行分析。结果妊娠结局正常者外周血中胎儿有核红细胞百分比为0.89%±0.81%,妊娠结局不良者为3.25%±2.98%,两者相比,P<0.05。以胎儿有核红细胞百分比>3.79%作为截断值,预测妊娠不良结局的敏感度为76.9%、特异度为64.3%。结论与妊娠结局正常的孕妇相比,妊娠结局不良孕妇孕12~18周时外周血胎儿有核红细胞增多；对孕12~18周孕妇外周血胎儿有核红细胞进行计数有助于不良妊娠结局的预测,其敏感度及特异度均较高。
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孕中期唐氏综合征血清筛查联合无创性产前基因诊断价值
目的:探讨孕中期血清筛查联合无创性产前基因诊断对降低唐氏综合征患儿出生率的意义.方法:采用时间分辨免疫荧光法检测孕14～20+6周1 242名孕妇血清甲胎蛋白和游离β-人绒毛膜促性腺激素水平,应用Multicalc软件计算唐氏综合征风险值.唐氏综合征高风险切割值为1∶270,≥1∶270为高风险孕妇;18-三体综合征高风险切割值为1∶350,≥1∶350为 18-三体综合征高风险孕妇.孕妇均抽取静脉血4～20 mL行胎儿细胞富集分离与鉴定,对胎儿有核红细胞进行单细胞基因分析,并应用基因扫描技术对短串联重复序列位点基因片段进行检测.结果:血清甲胎蛋白+游离β-人绒毛膜促性腺激素筛查出高风险孕妇35名,其中唐氏综合征高风险20名,18-三体综合征高风险9名,神经管缺陷高风险6名,阳性率2.8%.20名唐氏综合征高风险孕妇中,21号染色体短串联重复序列位点为三体图谱型6名,其中1∶1∶1基因型4名,2∶1基因型2名;1名2∶1基因型孕妇自然流产,对流产胎体进行细胞核分型,确诊为唐氏综合征,余5名活产新生儿经细胞核型分析确诊为唐氏综合征.1 207名低风险孕妇基因扫描均为正常二倍体1∶1基因型.结论:唐氏综合征血清筛查联合无创性产前基因诊断,可提高唐氏综合征产前诊断率,降低唐氏综合征患儿出生率.
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基于纳米技术从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞并进行无创性产前诊断的可行性
目的 建立一种基于纳米技术从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞并进行无创性产前诊断的方法.方法 Percoll 1.077单密度梯度离心法之后,选用抗体CD147修饰到以玻璃为载体的纳米羟基磷灰石基底上,对新生儿脐血中的胎儿有核红细胞进行捕获,利用胎儿特异性抗体HbF、红细胞表面特异性抗体CD71以及细胞核染色剂DAPI对捕获到的新生儿脐血中有核红细胞进行染色标记,进而实现分选.对正常不同孕周孕妇外周血、未孕健康妇女外周血及新生儿脐血中抗体CD147捕获到的有核红细胞进行染色标记分选.抽取10例行常规产检时发现高危因素的孕妇外周血2 mL,用抗体CD147捕获胎儿有核红细胞并用X、Y、18、21染色体探针进行荧光原位杂交.结果 用HbF+CD71双标记染色法的胎儿有核红细胞阳性率与HbF单染和CD71单染标记的细胞阳性率相比差异有统计学意义(P<0.05);HbF单染和CD71单染标记的阳性细胞率之间相比差异无统计学意义(P>0.05);在孕16~20周时孕妇外周血中阳性细胞数目达到顶峰,之后随孕周增加而呈下降趋势.10例高危孕妇外周血标本均成功分离出胎儿有核红细胞,并经过FISH鉴定,本方法对男性胎儿诊断的灵敏度为85.71%,特异度为100.00%,对女性胎儿诊断的灵敏度为100.00%,特异度为85.71%,同时诊断出1例非整倍染色体胎儿,所有结果均经后期随访证实.结论 用纳米材料为基底,抗体CD147捕获,HbF+CD71双染色标记法对孕妇外周血中的胎儿有核红细胞进行识别和富集,可提高胎儿有核红细胞的检出率,可为进一步产前诊断奠定基础,佳时机应该在孕16~20周.
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孕妇外周血中有核红细胞数与妊娠期高血压疾病的关系
目的：通过比较正常孕妇和妊娠期高血压疾病孕妇外周血中胎儿有核红细胞数量，了解孕妇外周血中胎儿有核红细胞数量变化与妊娠期高血压疾病之间的关系。方法：收集69例孕12～18周孕妇外周血，采用密度梯度离心法分离外周单个核细胞后使用 PE-GPA／FITC-CD71单克隆抗体标记胎儿有核红细胞后进行流式细胞计数，分析其与妊娠期高血压疾病之间的关联性。结果：妊娠期高血压疾病患者外周血中胎儿有核红细胞较正常妊娠者增多，对照组和病例组中 GPA＋／CD71＋百分比分别为（0．89±0．81）％和（3．57±3．48）％，其差异具有统计学意义（P ＜0．05）。结论：妊娠期高血压疾病患者外周血中胎儿有核红细胞增多，孕妇外周血中胎儿有核红细胞增加提示有患妊娠期高血压疾病的可能，应积极采取干预措施。
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单抗CD71用于荧光激活细胞分选法富集分选母血中的胎儿细胞
目的:研究转铁蛋白受体(CD71)抗体对单个核细胞的标记情况,探讨该单克隆抗体识别胎儿细胞的有效性.方法:选用CD71抗体对92例正常孕妇外周血、15例未孕妇女外周血和15例胎儿脐血单个核细胞进行标记,并用于荧光激活细胞分选法富集分选母血中的胎儿有核红细胞.结果:孕10～35周的孕妇外周血中CD71阳性细胞的比例为(5.59±4.83)×10-2,与未孕妇女外周血及胎儿脐血中CD71阳性细胞的比例比较,均差异有极显著性(P＜0.001).结论:孕妇外周血中存在胎儿细胞,单抗CD71可以作为一种有效识别抗体用于母血中胎儿细胞的分选,从而为进一步的无创性产前诊断工作打下基础.
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孕妇外周血中胎儿有核红细胞的分离、分析技术及其产前诊断应用的研究进展
现代医学蓬勃发展,诊断技术日新月异,目前在产前诊断领域,用孕妇外周血中胎儿有核红细胞进行产前诊断,因其具不对胎儿构成危害、损伤小,且适用于低风险孕妇大群体筛查等优点,因而被认为是今后具潜力的非侵入性产前遗传学诊断方法之一.近年来随着分子生物技术的飞速发展,经母血分离胎儿有核红细胞进行产前诊断的研究取得了显著进展,显示出良好的应用前景.
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孕妇外周血中分离胎儿细胞及应用
在每年出生的新生儿中,大约有2%的带有严重的身体、智力障碍,而其中遗传因素所致的占25%(基因因素20%、染色体因素5%).目前,由于高龄孕妇比例的不断增加和环境污染引起的胎儿畸形的发生率不断升高.产前诊断有利于降低非正常胎儿的发生率,因此受到广泛的关注.特别是近年来发展起来的用母血中的胎儿细胞进行的产前诊断因其非侵入性、对胎儿损伤小等特点成为研究的热点.
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N-乙酰半乳糖特异性植物凝素分离和富集胎儿有核红细胞
目的 采用N-乙酰半乳糖(N-Acetyl-D-galactosamine, GalNAc)包被的玻片分离和富集胎儿有核红细胞(fetal nucleated red blood cells,FNRBCs).方法 用密度梯度离心法收集胎儿脐血中的FNRBCs,然后将其与不同浓度的大豆凝聚素(SBA)混合,所形成的"FNRBCs-SBA"复合物用GalNAc包被的玻片来分离和富集,分析SBA工作浓度对FNRBCs分离和富集效率的影响.结果 当GalNAc包被玻片的浓度为100 μg/ml时,20 μg/ml 的SBA浓度是分离和富集FNRBCs的适浓度;此时WBC与有核红细胞的比值较低(27.7%), 而FNRBCs与有核红细胞的比值高(3.7%).结论 N-乙酰半乳糖特异性植物凝素可用于选择性地分离和富集FNRBCs,与传统方法相比较具有无需特殊仪器与设备,简便快速的优点.
