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CYP1A1基因cDNA全长的T载体克隆及序列分析
目的构建含KpnI、XhoI双酶切位点的人细胞色素(CYP1A1)基因cDNA全长的pGEM-T载体,为以后的亚克隆和毒理学研究提供实验材料.方法从培养的人乳腺癌细胞(MCF-7)中抽提总RNA,RT-PCR扩增CYP1A1基因cDNA全长,与pGEM-T载体连接后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行测序分析.结果重组质粒pGEM-T-1A1 PCR后获得了1 568 bp产物,酶切鉴定证实目的片段成功插入至pGEM-T,测序分析也进一步证明了目的片段与GeneBank中CYP1A1mRNA的序列同源性为99.9%.结论成功地构建了含CYP1A1基因cDNA全长区域的T载体.
关键词： 细胞色素P450(CYP1A1) T-载体 测序分析 -
T-载体在聚合酶链反应扩增产物克隆中的应用
目的探讨克隆聚合酶链反应(PCR)扩增产物的简便方法.方法用PCR方法分别特异性扩增Wilms瘤基因wt1和尿激酶受体(UPAR)基因,并利用Taq聚合酶具有的延伸酶活性将扩增产物直接克隆入T-载体,EcoRⅠ酶切鉴定阳性重组子.结果设计的引物可分别扩增wt1基因锌指区(343bp)和UPAR基因编码区全长(1083bp);未经修饰的常规PCR和高保真PCR扩增产物可被直接克隆入pGEM-T Easy载体,其中正确重组率为62.5%～87.5%;克隆的wt1基因和UPAR基因已被成功用于竞争性PCR或表达.结论 T-载体法是克隆PCR产物通用而有效的方法.
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利用人工合成XcmⅠ接头盒构建T-载体
目的采用人工法合成XcmⅠ接头盒，进而构建T-载体。方法用人工方法合成含XcmⅠ酶切位点的寡核苷酸接头，将其插入pBluescript SK Ⅱ（+）质粒的EcoRⅤ位点，以XcmⅠ消化含接头的质粒即构建成T-载体。利用PCR反应扩增PEA全长结构基因，直接克隆入T-载体以验证所构建T-载体的可用性。结果限制性酶切分析、DNA序列测定及PEA基因的克隆等均证实T-载体的构建成功。结论所构建的T-载体可有效用于直接克隆PCR产物。
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大容量人乳腺癌单链抗体库的构建与初步鉴定
目的利用细胞内重组技术构建大容量人乳腺癌单链抗体(scFv)库.方法收集30例乳腺癌外周转移淋巴结,依次提取总RNA、mRNA,RT-PCR扩增全套可变区基因(VL、VH),各自克隆到T载体,构建T载体库.然后从T载体上酶切VL、VH分步克隆到噬粒载体pDAN5,经电转化TG1得到初级库.辅助性噬菌体感染初级库,使噬菌体抗体表面呈现.提纯噬菌体抗体,滴定浓度后感染大肠杆菌BS1365进行细胞内重组.噬菌体挽救后再次提纯滴定噬菌体,感染大肠杆菌DH5αF＇,得到次级库,并测序验证.结果 VH、VL T载体库分别为3.5×108和1.7×108,初级库库容量2.5×109.次级库库容量为2.5×1011.结论所采用的引物能够高效扩增目的片段,T载体的应用能够提高抗体基因的克隆效率,细胞内重组将进一步扩大库容量及增加其多样性,这种基于RT-PCR、T载体过渡、细胞内重组的路线能够构建大容量抗体库.
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人BDNF成熟肽基因克隆及序列分析
为研究人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的表达及其在治疗Alzheimer病中的作用,本文作者等克隆了其成熟肽基因并进行了序列分析.提取健康成人末梢血白细胞基因组DNA作为模板,应用PCR技术扩增人脑源性神经营养因子成熟肽基因片段,并将其插入pGEM-T质粒.限制性内切酶鉴定重组质粒并进行序列测定和分析.与GenBank提供的已知序列(M61181)比较,所克隆的人脑源性神经营养因子成熟肽基因片段长357 bp,序列完全相同.人脑源性神经营养因子成熟肽基因的克隆,为其在原核细胞中的表达、抗体的制备及神经系统疾病的治疗奠定了基础.
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人神经生长因子的基因克隆和序列分析
目的克隆人神经生长因子基因编码区.方法由人末梢血白细胞中提取细胞总DNA,利用PCR法,从DNA中扩增出人神经生长因子编码区基因DNA片段;将获得的基因片段插入pGEM-T-Easy质粒中,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,利用限制性内切酶酶切核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒.结果经质粒DNA酶切分析及序列测定,获得了人神经生长因子DNA片段序列.结论首次由人白细胞DNA中克隆获得了人神经生长因子基因,为神经生长因子的基因治疗提供了前提条件.
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人脑源性神经营养因子基因克隆及序列分析
目的克隆人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因并进行序列分析.方法提取健康成人末梢血白细胞基因组DNA作为模板,应用PCR技术和T-载体克隆法克隆hBDNF基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定,并进行序列测定和分析.结果 DNA序列测定的结果与GenBank提供的已知序列(M61181)比较,所克隆的hBDNF基因从起始密码子ATG到终止密码子TAG全长共744bp,序列完全相同.结论自人基因组DNA中克隆hBDNF基因,为进一步开展阿尔茨海默病(AD)的基因治疗积累了资料.
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STR等位基因梯阶制备的研究
目的建立制备STR的等位基因梯阶标准对照的新方法.方法以T-质粒载体直接连接STR等位基因扩增产物,导人大肠杆菌,使其随大肠杆菌的无性繁殖而复制、扩增,获得单一DNA分子的大量拷贝;经PCR鉴定及测序分析后,制备出标准的STR等位基因梯阶对照(AL).结果所建方法制备出了标准AL;保存重组质粒及转染的大肠杆菌,可保证AL的大量快速制备,并能长期保存.结论该方法制备的AL在法医物证检验中有很高的应用价值,对STR试剂盒国产化有重要意义.
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T载体在噬菌体单链抗体库中的应用
目的将T载体用于提高PCR产物的克隆效率,以构建大库容量的噬菌体单链抗体库.方法用传统的直接酶切的方法处理抗体轻链,直接连到经相同酶切的表达载体构建轻链抗体库;同时制备T载体,将抗体轻链克隆于T载体建成T载体克隆文库,然后再把轻链从T载体上切下来克隆到噬粒表达载体pDAN5,构建轻链抗体库.比较两种方法的效率.结果制备的T载体质量较好,可以满足建库所需,轻链T载体库为28×108,经过T载体过渡比直接酶切连接效率要高出将近1000倍.结论T载体的应用较好的解决了PCR产物克隆困难的问题,能够用于大容量噬菌体单链抗体库的构建.
