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基于loxP-cre系统的细胞内重组技术
噬菌体呈现技术近年来得到不断改进和完善.基于loxP-cre系统的细胞内重组技术是为重要的改进.从双载体系统到单载体系统,从大样本抽样测序到肉眼直观判断,它使大库容量天然抗体库的构建变得简单易行,并有利于高亲和力抗体的获取.现对其改进和完善过程进行综述.
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恶性肿瘤基因治疗结合放射治疗的研究进展
肿瘤的基因治疗是当前医学和生物学的一个新的研究领域,它是通过将外源性 DNA片段即目的基因稳定地插入到靶细胞基因中,使其在肿瘤部位表达高浓度产物或在体外相关细胞内重组后再导入体细胞中表达,从而抑制肿瘤恶性表型,达到控制肿瘤细胞生长和繁殖的目的.目前基因治疗研究在细胞和动物实验阶段已取得了一定的成果,有不少方法已进入临床试验阶段,但其临床治疗疗效并不令人满意 [1].基因治疗尚不能取代手术、放疗、化疗等常规治疗手段,但研究已表明其可用来提高放疗、化疗的敏感性,减少肿瘤的复发和转移等 [2].本文将就近几年来基因治疗结合放疗治疗恶性肿瘤的研究进展作一简要综述.
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抗人SARS病毒单链抗体库的构建
目的:利用细胞内重组的方法, 构建大库容量的人源性抗SARS病毒单链抗体(scFv)库, 为筛选SARS病毒抗原的人源性抗体奠定基础.方法: 取6例SARS康复患者的80 mL 外周血, 分离淋巴细胞后提取总RNA.分离纯化mRNA 并反转录成cDNA后, 扩增抗体重链、轻链可变区基因片段.然后经重叠延伸PCR装配成scFv基因并克隆入噬粒载体pDAN5中, 电转化大肠杆菌TG1构建初级抗体库.制备初级库噬菌体后, 感染大肠杆菌BS1365进行细胞内重组制备次级抗体库.结果: 初级库库容量为3×109, 在大肠杆菌BS1365中重组后得到3×1011的次级抗体库.结论: 细胞内重组方法的应用可使大库容量抗体库的构建变得简单易行.构建的抗SARS病毒单链抗体次库不仅接近人类天然抗体库的水平, 而且多样性好, 为筛选抗SARS病毒抗原的抗体提供了保证.
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大容量人乳腺癌单链抗体库的构建与初步鉴定
目的利用细胞内重组技术构建大容量人乳腺癌单链抗体(scFv)库.方法收集30例乳腺癌外周转移淋巴结,依次提取总RNA、mRNA,RT-PCR扩增全套可变区基因(VL、VH),各自克隆到T载体,构建T载体库.然后从T载体上酶切VL、VH分步克隆到噬粒载体pDAN5,经电转化TG1得到初级库.辅助性噬菌体感染初级库,使噬菌体抗体表面呈现.提纯噬菌体抗体,滴定浓度后感染大肠杆菌BS1365进行细胞内重组.噬菌体挽救后再次提纯滴定噬菌体,感染大肠杆菌DH5αF＇,得到次级库,并测序验证.结果 VH、VL T载体库分别为3.5×108和1.7×108,初级库库容量2.5×109.次级库库容量为2.5×1011.结论所采用的引物能够高效扩增目的片段,T载体的应用能够提高抗体基因的克隆效率,细胞内重组将进一步扩大库容量及增加其多样性,这种基于RT-PCR、T载体过渡、细胞内重组的路线能够构建大容量抗体库.
