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甲醛对HepG2细胞凋亡的影响
目的 探讨甲醛对HepG2细胞凋亡的影响.方法 以0.004、0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 mmol/L的甲醛(formaldehyde)分别处理人肝癌HepG2细胞24和48 h,采用MTT法检测细胞活性.分别以0.004、0.02、0.1 mmol/L的甲醛处理人肝癌HepG2细胞24和48 h,采用Western blot法检测p53、mdm2、Caspase-3、RIP1、RIP3和NF-B的蛋白表达水平.结果 与阴性对照组相比较,0.5 ～ 12.5 mmol/L FA染毒24和48 h可显著降低HepG2细胞活性(P＜0.05);染毒24 h后Caspase-3蛋白表达降低(P＜0.05);p53、p-p53、mdm2、RIP3表达水平在染毒24和48 h后均明显降低(P＜0.05);cleaved RIP1表达水平在0.1 mmol/L剂量染毒24和48 h后表达增加(P＜0.05)上述变化均有统计学意义;染毒24和48 h后NF-κB蛋白表达无明显变化.结论 甲醛可能是通过死亡受体途径而不是线粒体途径引起肝细胞凋亡.
关键词： 甲醛 HepG2细胞 凋亡 受体相互作用蛋白激酶1 -
程序性坏死机制与缺血再灌注损伤
程序性坏死是一种具有可调控的信号传导通路的细胞坏死方式.多种刺激可导致程序性坏死的发生,复合体Ⅰ、复合体Ⅱ和RIP1-RIP3坏死体是通路中的信号分子,而Necstatin-1是程序性坏死的特异性阻断剂.程序性坏死可能是缺血再灌注损伤中细胞死亡的重要方式.
关键词： 程序性坏死 受体相互作用蛋白激酶1 受体相互作用蛋白激酶3 -
坏死性凋亡在干细胞移植改善心搏骤停后神经功能的作用
目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对心搏骤停(CA)后大鼠脑组织受体相互作用蛋白激酶1和3(RIP1和RIP3)表达的影响.方法 该实验在福建省急诊医学研究所完成.SD大鼠随机(随机数字法)分为sham组(n=8)、CA组(n=8)和MSCs组(n=8).通过窒息法诱导CA后进行心肺复苏(CPR),复苏后1h,MSCs组和CA组分别经尾静脉注射1×106/0.5mL MSCs与等体积磷酸盐缓冲液.CPR后3d,对各组大鼠进行神经功能缺损评分(NDS),荧光显微镜下检测MSCs在脑内分布,脑组织HE染色观察皮层坏死神经元,Western blot检测脑组织RIP1和RIP3表达水平.组间比较采用方差分析或Kruskal-Wallis H检验.结果 CPR后3d,MSCs组NDS明显高于CA组[72.5(71.5,73.2)与63.0(62.5,64.1),Z=3.376,P=0.001],DAPI标记的MSCs主要分布在脑皮层,MSCs组皮层坏死神经元明显低于CA组[(29.6±5.9)％与(57.2±6.4)％,t=8.922,P＜0.01],MSCs组脑组织RIP1和RIP3表达水平均低于CA组[RIP1:0.227(0.193,0.243)与0.599(0.535,0.629),Z=3.151,P=0.001;RIP3:0.217(0.203,0.274)与0.543(0.533,0.555),Z=3.361,P=0.001].结论 MSCs移植可能通过抑制坏死性凋亡从而改善CPR后大鼠神经功能.
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亚低温对颅脑创伤后受体相互作用蛋白激酶-1表达影响的实验研究
目的 探讨亚低温对颅脑创伤(TBI)后大鼠脑组织受体相互作用蛋白激酶-1(RIPK-1)表达的影响.方法 成年雄性7周龄Wistar大鼠40只,按随机数字表顺序分为5组:正常组(Normal)、假手术组(Sham)、假手术联合亚低温组(Sham+ HT)、颅脑创伤常温组(TBI,37℃)、颅脑创伤亚低温组(TBI+ HT,32℃),每组8只.建立液压打击致TBI模型后即可采用亚低温干预持续6h.采用神经功能缺损评分(NSS)观察TBI前后行为改变.伤后48 h处死大鼠并取脑组织行HE染色,分别采用RT-PCR、real-time PCR和免疫印迹(Western-blot)法检测RIPK-1在基因和蛋白水平的表达,并用免疫组化法检测其在细胞水平的定位.结果 与TBI组比较,TBI+ HT组NSS评分明显降低(P＜0.01).TBI组中RIPK-1的基因和蛋白表达明显高于Sham组(P＜0.05),而TBI+HT组RIPK-1表达较TBI组显著降低(P＜0.05).RIPK-1蛋白在神经元和胶质细胞均有表达,而且TBI+ HT组RIPK-1表达显著降低(P＜0.05).结论 亚低温可能通过抑制RIPK-1诱导的细胞坏死性凋亡通路来发挥神经保护作用,这为TBI的新靶向治疗提供了实验依据.
关键词： 颅脑创伤 亚低温 受体相互作用蛋白激酶1 坏死性凋亡 -
RIPK1是抑制膀胱肿瘤干细胞的潜在分子靶标
目的:探讨受体相互作用蛋白激酶1 (receptor interacting protein kinase 1,RIPK1)对膀胱肿瘤干细胞增殖及成瘤能力的影响.方法:应用核素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术结合液相色谱和串联质谱(liquid chromatography with tandem-mass spectrometry,LC-MS)分析小鼠膀胱癌MB49细胞与MB49膀胱癌干细胞(MB49 bladder cancer stem cells,MCSCs)间的差异表达蛋白.将靶向RIPK1基因的特异性siRNA转染至MCSCs后,应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测RIPK1 mRNA和蛋白的表达,CCK-8法检测RIPK1 siRNA对MCSCs增殖的影响,裸鼠成瘤实验观察RIPK1 siRNA对MCSCs体内成瘤能力的影响.结果:筛选出MB49细胞与MCSCs间差异表达蛋白共65个,其中29个蛋白在MCSCs中的表达水平上调,36个蛋白的表达水平下调.MCSCs中RIPK1蛋白表达水平是MB49细胞的4.99倍.RIPK1 siRNA转染组MCSCs中RIPK1 mRNA和蛋白表达水平均下降(P值均＜0.05),并且RIPK1 siRNA转染组MCSCs的体外增殖和体内成瘤能力均受到抑制(P值均＜ 0.05).结论:膀胱肿瘤干细胞中RIPK1的表达与膀胱癌细胞的体外增殖和体内成瘤有关.
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程序性坏死参与油酸诱导的大鼠急性呼吸窘迫综合征的发病过程
本研究旨在明确程序性坏死在急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)发病中的作用.通过尾静脉注射油酸(oleic acid,OA)制备大鼠ARDS模型,并观察4h.通过动脉血气分析、肺干湿重比(lung wet-dry weight ratio,W/D)、肺组织HE染色及肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中总蛋白测定、白细胞计数及分类计数来评估ARDS模型.通过ELISA检测BALF中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)水平.通过免疫组化和蛋白免疫印迹观察受体相互作用蛋白激酶1 (receptor interacting protein kinase 1,RIPKl)、RIPK3、mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL)在肺组织中的表达水平.通过免疫沉淀观察RIPK1和RIPK3之间的相互作用.结果显示,OA注射4h后,与对照组比较,OA组大鼠肺泡-动脉氧分压差[P(A-a)O2]、W/D、BALF中白细胞总数、中性粒细胞比例、蛋白浓度及TNF-α水平均显著上升,而氧合指数(PaO2/FiO2)下降;OA组大鼠肺组织中RIPKl、RIPK3、MLKL表达明显增加,且RIPK1与RIPK3之间的相互作用显著增强.以上结果表明,在ARDS的发生、发展过程中,TNF-α分泌增加,RIPKl/RIPK3/MLKL信号通路被激活并表达上调,提示程序性坏死可能在ARDS的发病机制中发挥作用,这可能为治疗ARDS的新药开发提供新思路.
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Necroptosis与疾病的关系
Necroptosis作为一种新发现的细胞死亡形式,在近些年成为研究的热点,Necroptosis是一种可被机体内多种信号转导因子高度调控的程序性坏死路径,属于细胞程序性死亡方式的一种特殊类型,被称为细胞程序性坏死或坏死性凋亡.该过程依赖于受体相互作用蛋白激酶RIP3及其底物混合谱系激酶结构域MLKL,且抑制剂Necrostain-1以及MLKL、PGAM5、RIP1、RIP3构成的坏死复合物是细胞程序性坏死的重要调节因子,坏死复合物的构成和磷酸化过程是Necroptosis的关键性步骤,也是Necroptosis发生的特异性标志.Necroptosis已经被认为是在病理环境下发生的细胞死亡和炎症的重要原因,与诸多疾病的病理和器质损伤有关,例如神经病变,病毒感染,心、脑、肾的缺血-再灌注损伤,恶性肿瘤和许多其它的病理情况等.该文将从Necroptosis的基本特点、机制以及与疾病的关系等多个方面进行概述.
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受体相互作用蛋白激酶1在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义
目的 探讨受体相互作用蛋白激酶1(RIPl)蛋白在食管鳞癌中的表达情况及临床意义.方法 应用Western blot法和免疫组织化学法检测并且分析100例食管鳞癌患者的癌组织、相应癌旁组织和对应正常黏膜组织中RIP1的表达情况.结果 71％食管鳞癌组织中RIP1蛋白的表达水平高于对应癌旁组织和正常黏膜组织,20％食管鳞癌癌旁组织RIP1蛋白的表达水平高于对应癌组织和正常食管黏膜组织,差异有统计学意义(P＜0.05).食管鳞癌组织中高表达的RIP1蛋白水平与其TNM分期、病理分级、有无淋巴结转移有关(P＜0.05),与性别、年龄无关.癌旁组织中高表达的RIP1蛋白水平与肿瘤浸润深度、TNM分期有关(P＜0.05),与性别、年龄、有无淋巴结转移及病理分级无关.结论 RIP1蛋白在食管鳞癌中的高表达可能与肿瘤的病理分级、TNM分期及预后有关,对于食管鳞癌的发生发展有一定的预测作用.
关键词： 食管肿瘤 鳞状细胞 免疫组织化学 受体相互作用蛋白激酶1 -
程序性坏死研究进展
程序性坏死是近年来发现的一种由死亡受体介导的caspases非依赖性细胞死亡模式,通常在凋亡被抑制的情况下发生,具有坏死细胞的形态学特征.研究发现程序性坏死同细胞凋亡一样受细胞内信号因子的周密调节,激酶受体相互作用蛋白激酶1和受体相互作用蛋白激酶3是其关键的调控因子.程序性坏死在炎症性病变、缺血性心脑血管病、神经退行性疾病等多种疾病的发生发展及肿瘤细胞的耐药方面具有重要意义.
关键词： 程序性坏死 受体相互作用蛋白激酶1 受体相互作用蛋白激酶3 肿瘤耐药性 -
肾脏疾病中Necrostatin-1的作用研究进展
坏死性凋亡是一种非半胱天冬酶依赖的细胞程序性死亡方式,它通过死亡受体及精确的细胞通路来介导发生.在坏死性凋亡途径的激活中,受体相互作用蛋白激酶1和3(RIP1/3)扮演着重要的角色,上游的信号分子启动后,RIP1可以发生泛素化、去泛素化、磷酸化等一系列的反应,当蛋白激酶8被抑制时,RIP1与RIP3发生相互磷酸化,并形成了坏死性凋亡小体,从而介导了坏死性凋亡的发生.Necrostatin-1 (Nec-1)是RIP1的特异性阻断剂,可以阻断RIP1发生磷酸化,进而使细胞不发生坏死性凋亡.本文对坏死性凋亡的产生机制、Nec-1的结构和作用机制以及Nec-1在肾脏疾病方面应用的研究进展作一个综述,希望能够为肾脏疾病的诊断和治疗提供一些思路及靶点.
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受体相互作用蛋白激酶1在血管平滑肌细胞表型转换中的作用研究
血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转换在多种血管疾病中起着重要作用,因此本研究旨在探索受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)在血管平滑肌细胞表型转换中的表达变化及其可能起到的作用.通过血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激建立VSMCs表型转换模型,分别采用定量PCR、Western blot检测VSMCs表型转换及分泌标志物、RIPK1的表达和核因子-κB (NF-κB)的P65亚基磷酸化水平的变化,5-乙炔基-2脱氧尿嘧啶核苷(EdU)掺入法检测细胞增殖变化,并用划痕实验检测细胞迁移情况.同时,应用RIPK1特异性小分子抑制剂Necrostatin-1(Nec-1),以及特异性RIPK1-siRNA抑制RIPK1的表达,观察RIPK1在VSMCs表型转换中的作用.结果显示,AngⅡ诱导VSMCs发生表型转换后,RIPK1表达及P65磷酸化的水平明显增加.给予Nec-1预处理或是利用RIPK1-siRNA沉默RIPK1基因后,P65的磷酸化水平呈现下调,同时能部分逆转VSMCs的表型转换并抑制其分泌、增殖和迁移能力.实验表明,AngⅡ能诱导RIPK1表达上调,同时RIPK1可能通过促进NF-κB的P65亚基磷酸化参与了VSMCs的表型转换过程.
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RIP1/RIP3通路介导氯化血红素诱导的HT-22海马神经细胞损伤的研究
目的 探索受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)/RIP3通路是否参与氯化血红素(hemin)诱导的HT-22海马神经细胞损伤以及研究Necrostatin-1(Nec-1)在hemin诱导的HT-22细胞死亡中潜在的神经保护作用.方法 给予不同浓度的hemin(0、25、50、100μmol/L)作用HT-22细胞24 h后测定碘化丙啶(PI)阳性细胞数和细胞存活率.用Necrostatin-1、zVAD和活性氧(ROS)清除剂叔丁基茴香醚(BHA)分别处理hemin诱导的HT-22细胞,24 h后分别测定各组PI+细胞数、细胞存活率,使用MitoSox Red指示ROS水平.后研究使用siRNA敲低RIP3水平对hemin诱导HT-22细胞死亡的影响,测定各组PI+细胞数、细胞存活率及ROS水平.结果 Hemin可剂量依赖性的诱导HT-22神经细胞死亡;RIP1抑制剂Necrostatin-1可显著抑制hemin诱导的HT-22细胞死亡,PI+细胞数明显减少,细胞存活率提高,并且减少ROS积聚;BHA可显著减少hemin诱导的HT-22细胞的PI+细胞数.更进一步的使用siRNA敲低RIP3表达水平可以显著减少hemin诱导的HT-22细胞死亡,PI+细胞数明显减少,细胞存活率明显提高,ROS积聚水平显著减低.结论 RIP1/RIP3通路及ROS可能介导hemin诱导的HT-22海马神经元细胞死亡,Necrostatin-1在其中起神经保护作用.
