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彗星试验检测DNA交联及其修复效应的研究
DNA交联一般分为DNA-蛋白质交联(DNA-proteincrosslinks,DPC)和DNA-DNA交联(DNA-DNA crosslinks,DDC)两类,它们都是环境污染物和化学致癌物引起的生物大分子物质发生遗传损害的结果.与其他类型DNA损伤相比(如DNA链断裂),DNA交联较难修复或易于发生易错修复,在细胞周期中维持时间较长.当DNA复制时,一些重要的基因容易丢失,且经常发生染色体断裂,甚至致死性突变[1,2].故筛检环境化学物的DNA交联性损伤和观察其修复效应具有极其重要的意义.然而,由于检测方法的局限,极大地制约了这一领域的应用.近年来发展十分迅速的彗星试验(Comet assay)用于检测DNA交联和修复在理论上是可行的.
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一种更新的检测DNA交联的尝试
DNA交联是外来化学物作用于DNA所致的重要遗传损伤,与其他类型DNA损伤相比,DNA交联较难修复或易于发生易错修复,在细胞周期中维持时间较长.当DNA复制时,一些重要的基因容易丢失,且经常发生染色体断裂,甚至致死性突变[1,2].故筛检环境化学物的DNA交联性损伤具有极其重要的意义.然而,由于检测方法的局限,极大地制约了其应用.近年来,国内外偶有将彗星试验(Comet assay)用于检测DNA交联的报道[3,4],但很不系统和全面.本室在深入挖掘彗星试验的应用前景时,首次探讨了通过增加电压或延长电泳时间来检测DNA交联的新思路,现报道如下.
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烹调烟雾冷凝物对DNA完整性影响的研究
采用体外作用的方式探讨烹调烟雾致遗传损伤的机制.通过细胞毒性试验得出:油烟冷凝物与大鼠肺Ⅱ型细胞生长抑制率之间存在剂量-效应关系(r=0.943,P<0.01),剂量在20 μg/ ml及以上对细胞有明显毒性作用.在不产生细胞毒性作用的剂量范围内,单细胞凝胶电泳试验表明:大鼠肺Ⅱ型细胞经油烟冷凝物染毒2小时可引起细胞DNA链断裂,在0～5μg/ml剂量范围内,损伤程度与剂量存在直线相关关系(r=0.918,P<0.05);在10μg/ml剂量下,DNA损伤已达大程度.发生DNA损伤的细胞经修复培养2小时后受损伤的DNA能被修复.油烟冷凝物对30μg小牛胸腺DNA交联试验显示:在50～800μg剂量范围,DNA交联率与受试物间存在剂量-效应关系(r=0.963,P<0.01). 提示烹调烟雾冷凝物在较低作用剂量下就可导致大鼠肺Ⅱ型细胞DNA损伤,在一定剂量下可以导致DNA交联率的增加.
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维生素E琥珀酸脂对顺铂致人胚肾细胞毒性的保护作用
目的 研究维生素E琥珀酸脂(Vitamin E succinate,VES)对顺铂(cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)所致人胚肾293( HEK293)细胞毒性的保护作用.方法 体外培养人胚肾293细胞(HEK293),设空白对照组、VES(20 μg/ml)对照组、CDDP(25 μg/ml)单独染毒组以及低剂量CDDP( 25 μg/ml )+VES(5 μg/ml)联合处理组、中剂量CDDP(25 μg/ml)+VES( 10 μg/ml)联合处理组、高剂量CDDP( 25 μg/ml )+VES( 20 μg/ml)联合处理组,染毒12h.采用MTT法观察细胞增殖效应,测定细胞还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量和细胞培养液中乳酸脱氧酶(LDH)活力,采用荧光法检测DNA链间的交联情况.结果 与CDDP单独染毒组比较,各剂量CDDP+VES联合处理组HEK293细胞的存活率均升高,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).VES能明显抑制CDDP所致HEK293细胞MDA含量和细胞培养液中LDH活力的升高,并能提高细胞GSH的含量(P＜0.05,P＜0.01).高剂量CDDP+VES联合处理组HEK293细胞的交联率低于CDDP单独染毒组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 VES能抑制CDDP所致HEK293细胞的细胞毒性,其机制可能与VES的抗氧化作用和对DNA损伤的防护作用有关.
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冷应激致雏鸡肺脏DNA的氧化损伤作用
目的:探讨冷应激对雏鸡肺脏DNA氧化损伤的影响.方法:以健康15日龄雏鸡为试验对象,进行冷应激(12±1℃)处理.检测了肺脏MDA含量以及SOD和GSH-Px活性,并应用KCL-SDS沉淀法和荧光检测法检测肺细胞DNA-蛋白质交联(DPC)系数和DNA-DNA交联(DDC)系数.结果:冷应激时,肺脏MDA含量随应激时间的延长逐渐升高,SOD、GSH-Px活性随应激时间的延长呈现上升趋势,肺细胞DPC和DDC含量也均随应激时间的延长呈升高趋势.结论:揭示冷应激可使肺组织氧化.抗氧化平衡破坏,引起肺组织细胞DNA的氧化损伤.
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甲醛致淋巴细胞DNA交联作用的体内外实验研究
目的研究甲醛对小鼠胸腺淋巴细胞DNA的交联作用,探讨甲醛的遗传毒性作用及机制.方法分别以γ射线及紫外线作为标准断裂剂,用单细胞凝胶电泳技术对不同浓度甲醛诱导的小鼠胸腺淋巴细胞DNA交联作用进行体内及体外实验研究.结果体内和体外研究均显示,甲醛可以引起小鼠胸腺淋巴细胞DNA的交联作用;体外研究还发现,随着甲醛浓度的增加,交联作用加强,彗星细胞率分别为100%,76%,2%,平均尾长分别为15.32,9.79,5.02 μm.结论甲醛是一种DNA交联剂,具有诱导小鼠胸腺淋巴细胞DNA交联的作用.
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丙烯腈对DNA交联作用研究
目的应用牛胸腺DNA和染毒丙烯腈(AN)小鼠精细胞研究AN对DNA的交联作用,研究AN毒作用的分子机制.方法应用溴化乙锭荧光法测定加或不加S9条件下AN对牛胸腺DNA交联作用.雄性小鼠随机分为阴性对照,3、6、9、12、18和24 mg/kg AN染毒组,每组2只.腹腔注射染毒1次,于染毒第24 h处死小鼠,分离精细胞,观察细胞存活率,测定精细胞DNA交联率.结果加与不加S9条件下,AN对牛胸腺DNA均未产生交联作用.小鼠精细胞DNA交联率在3、6、9 mg/kg AN剂量范围内随剂量增加而升高,呈明确的剂量-反应关系(r＝0.935,P＜0.05).结论在体外实验中AN对牛胸腺DNA未产生交联作用,对小鼠精细胞DNA在较低剂量时产生了交联作用,高剂量产生断裂作用和交联作用.AN对精细胞的DNA交联作用可能是产生生殖毒作用的分子机制之一.
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二氯甲烷遗传毒性的体外实验研究
[目的]探讨二氯甲烷(DCM)对DNA的损伤作用.[方法]应用吸收光谱移动法观察不同浓度的DCM(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0μg/μl)与小牛胸腺DNA的加合作用;应用溴乙锭荧光法对不同浓度的DCM(每30μgDNA分别为200、300、400、500、600、700μg)引起的DNA交联作用.[结果]加入2.0～7.0μg/μl的DCM后,DNA的紫外大吸收峰普遍发生长移(与阴性对照组比较,P<0.05),而且存在剂量-反应关系;每30μg小牛胸腺DNA用200～700μg的DCM直接染毒,DNA交联率由5.53%上升至17.63%,并且具有一定的剂量-反应关系(r=0.979,P<0.05).[结论]表明DCM能够与小牛胸腺DNA发生加合作用和交联生成作用.
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彗星试验检测甲醛对V79细胞的DNA交联作用
目的研究甲醛对V79细胞DNA的交联作用,探讨甲醛的遗传毒性及机制.方法以紫外线照射作为标准断裂剂,用彗星试验检测不同浓度、不同暴露时间甲醛诱导的V79细胞DNA的交联作用.结果除75 μmol/L组外,在其它4个浓度组、3个染毒时间点,甲醛均可引起显著的DNA交联作用,彗星尾长和彗星细胞率显著低于仅紫外线照射的对照组(P<0.01),且彗星尾长具有明显剂量-反应关系(P<0.01).细胞暴露在甲醛中2、4 h,150、300、600 μmol/L浓度组彗星尾长和彗星细胞率显著低于暴露在1 h的(P<0.01).结论甲醛是一种DNA交联剂,具有诱导V79细胞DNA交联的作用,DNA交联的作用可作为甲醛致机体影响的生物标志物.
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甲醛和丝裂霉素C的DNA交联作用研究
目的:探讨用彗星试验检测DNA交联剂作用的时间-效应关系及验证其应用的可行性.方法:以过氧化氢(H2O2)作标准DNA断裂剂,用彗星试验对甲醛诱导TK6细胞DNA交联作用的时间-效应关系进行了探讨,并用甲醛和丝裂霉素C进行了验证.结果:在一定浓度范围内,随着甲醛和丝裂霉素C浓度的增加,由H2O2造成的TK6细胞DNA迁移距离逐渐减小.时间效应的研究表明,在H2O2浓度一定时,随着甲醛染毒时间的延长,其DNA交联作用增加.结论:彗星试验既可检测DNA-蛋白质交联又可检测DNA-DNA交联,对DNA-蛋白质交联的检测更敏感.
