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猪链球菌2型组氨酸三聚体蛋白原核表达
目的 鉴定猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2,S. suis2)组氨酸三聚体蛋白(Histidine Triad Pro-tein,HTP),并研究该蛋白的免疫原性,为研究S.suis 2保护性疫苗奠定实验基础.方法 通过与相关家族蛋白进行同源性比较,在猪链球菌z型05ZYH33全基因组序列中发现了编码HTP的基因.设计合成引物,进行PCR扩增,并将目的 片段克隆到表达载体pET28a,表达并纯化出目的 蛋白,通过蛋白印迹(Western blot)检测其免疫原性.结果 PCR扩增出约2.7 kb的片段,并成功表达分子量在110 KD左右的目的 蛋白.通过His-Tag亲和层析,获得纯度较高的融合蛋白.Western blot检测结果表明,该表达产物具有免疫原性.结论 S.suis 2中国强毒株中存在HTP,并具有良好免疫原性,可作为S.suis 2免疫保护性疫苗候选分子.
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组氨酸三聚体蛋白在2型猪链球菌的定位
目的 研究组氨酸三聚体蛋白(histidine triad protein,Htp)在2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,S.suis 2)05ZYH33中的定位,以及sortase A(srtA)基因缺失对该蛋白表达的影响.方法 通过生物软件分析Htp氨基酸序列的分子特征;以纯化的Htp重组蛋白为免疫原,免疫新西兰兔,获得兔抗Htp抗血清;利用western blotting和ELISA检测该抗体的特异性和效价;以抗Htp抗体为工具通过流式细胞术验证Htp在菌体表面的定位,并比较05zYH33和srtA基因敲除突变株△srtA菌体表面Htp的表达量.结果 生物软件预测发现Htp存在信号肽和跨膜序列,具备表面蛋白的特征;流式细胞分析发现Htp定位于s.suis2表面;△srtA菌体表面Htp的量明显少于野生型菌株.结论 本研究明确了Htp在S.sui2菌体表面的定位并发现srtA基因敲除后细菌表面的Htp有所减少,为进一步研究Htp在猪链球菌致病过程中发挥的功能及其调控机制奠定了基础.
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2型猪链球菌组氨酸三聚体蛋白家族05SSU1267的克隆、表达及免疫保护作用研究
目的 对2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S suis 2)05ZYH33组氨酸三聚体蛋白家族(Histidine triad protein,Htp)成员编码基因05SSU1267进行克隆、表达,并研究其免疫保护作用.方法 根据05ZYH33基因组编码的05SSU1267基因序列设计引物,PCR扩增目的片段.将目的基因克隆入原核表达载体pET32a,并转化E.coli BL21(DE3).通过IPTG诱导表达、His-Tag亲和层析柱纯化获得重组蛋白,并将纯化后的蛋白用于Westem blot分析.以纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备兔多抗血清,并通过ELISA检测多抗血清的效价.重组蛋白免疫Balb/c小鼠,研究其免疫保护作用.结果 Western blot显示重组蛋白可以与兔抗05ZYH33全菌血清反应,显示该蛋白具有较好的免疫反应原性；ELISA结果显示重组蛋白免疫新西兰兔后获得高效价的多抗血清；动物保护实验表明该蛋白具有一定的免疫保护作用.结论 在原核系统成功表达了05ZYH33 Htp蛋白05SSU1267,动物实验结果表明其能够在Balb/c小鼠中发挥一定的免疫保护作用,研究结果为Htp蛋白作为2型猪链球菌疫苗候选分子以及进一步了解该蛋白家族的生物学功能奠定基础.
