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HBV多表位复合基因在NS-1细胞的表达
目的研究HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因在哺乳动物细胞NS-1内的表达.方法 PCR扩增HBc 1～72 aa及93～183 aa编码序列并合成HBV多表位复合基因,定向克隆至pcDNA3.1(+).经双酶切及核苷酸序列测定等方法筛选阳性克隆.阳性质粒以Lipofectamine介导转染NS-1细胞,通过ELISA及间接免疫荧光等方法检测细胞表达产物.结果双酶切及测序结果证实阳性质粒正确克隆了约890 bp的HBc与HBV多表位复合基因的杂合基因.重组子成功转染NS-1细胞并表达HBc-Mep融合蛋白.结论 HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因在哺乳动物细胞NS-1内正确表达目的蛋白.为研究pHBc-Mep作为DNA疫苗的免疫活性奠定基础.为后期检测核酸疫苗pHBcMep的细胞免疫效果提供靶细胞.
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HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞中的转染与表达
目的观察HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞株HepG2细胞内表达情况.方法将构建的HBc与HBV多表位复合基因真核表达质粒pHBcMep以Lipofectamine介导转染HepG2细胞,通过间接免疫荧光、Western-blot检测表达产物.结果经G418筛选的阳性转染细胞经间接免疫荧光染色后在紫外光激发时发出明显的荧光,而未转染质粒或转染pcDNA3.1的HepG2细胞则无明显荧光.Western-bot结果显示表达产物约为33kDa,并能与抗preS2多抗特异性结合.结论 HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞内获得正确表达.
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以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体的构建
目的构建以HBV HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达质粒,以探讨HBV基因免疫的新途径.方法 PCR扩增HBc第1～72aa及93～183aa编码序列并定向克隆至pcDNA3.1的NheⅠ/XhoⅠ位点,构建真核表达载体pHBcdM.合成HBV多表位基因并插入HBc原脊区基因位点,构建HBc-Mep融合基因真核表达质粒.经PCR、酶切及序列测定等方法筛选阳性质粒.结果双酶切及测序结果证实阳性质粒正确克隆了约885bp、编码HBc与HBV多表位的复合基因.结论成功构建了以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体pHBc-Mep,为研究pHBc-Mep作为DNA疫苗的免疫活性奠定基础.
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稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS-1细胞株的筛选与鉴定
目的建立稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS-1细胞株.方法将以HBV多表位复合基因取代脊区基因的杂合HBc真核表达质粒转染NS-1细胞,经G418及亚克隆筛选高表达阳性细胞株,并以RT-PCR、ELISA、间接免疫荧光及Western blotting等方法检测、鉴定重组细胞表达产物.结果筛选所得稳定表达细胞株经RT-PCR、ELISA、间接免疫荧光及Westernblotting等方法检测均呈阳性反应,而阴性对照及空白对照未出现相应阳性反应.结论筛选获得稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组细胞株,命名为NS/HBc-Mep.为建立HBc-Mep特异的cELISA及CTL活性测定等实验方法提供可靠的靶细胞.
