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报告基因方法对壬基酚、双酚A雌激素样活性的体外研究
目的利用基于报告基因的MCF7细胞体外雌激素检测方法对壬基酚(NP)、双酚A(BPA)的雌激素样活性及作用机制进行研究.方法合成人雌激素反应元件(ERE)核心片断并将其插入pGL3-promoter载体的多克隆位点构建而成雌激素反应元件ERE调控的报告质粒pERE-Luc,用脂质体转染法将pERE-Luc及内对照质粒phRL-SV40瞬时转染MCF7细胞,用17β雌二醇(E2)、三苯氧胺(Tam)、壬基酚、双酚A等处理后检测报告基因荧光素酶的表达.结果转染pERE-Luc的MCF7细胞的报告基因表达与E2呈明显的剂量-反应关系,1×10-11mol/L E2可引起报告基因的表达,至1×10-9mol/L可达到大表达值,而未转染pERE-Luc时与E2无明显反应,三苯氧胺可以显著抑制E2引起的报告基因的表达.1×10-6mol/L以上NP和BPA出现雌激素样作用.NP的雌激素样活性略强于BPA.结论本试验建立并采用的基于报告基因的体外雌激素检测方法是可行的,NP和BPA有一定的雌激素样活性作用.
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MLT抑制E2诱发的大鼠垂体PRL瘤的增生涉及雌激素受体的作用
目的:探讨褪黑素(melatonin,MLT)抑制17-β-雌二醇(17-β-estradiol,E2)诱发垂体催乳素(prolactin,PRL)瘤的增生及其机制的初始阶段,MLT对雌激素受体的作用.方法:在体实验采用每日定时给各组SD大鼠分别皮下注射不同浓度的MLT,建立MLT抑制E2诱发的垂体PRL瘤增生的动物模型.离体实验采用原代培养细胞原位杂交方法,探讨垂体PRL瘤细胞MLT受体的表达、MLT对雌激素受体(ER)表达的作用;应用电泳迁移率改变(EMSA)的方法,观察MLT对雌激素受体(ER)与雌激素反应元件(ERE)结合的效应.结果:每只大鼠每日定时皮下注射0.25或0.50 mg MLT能显著抑制E2诱发的垂体PRL瘤的增生(分别P＜0.01、P＜0.05);E2诱发的垂体PRL瘤细胞内有MLT受体MLT1a和MLT1b;给0.25 mg/day/rat MLT组的大鼠垂体PRL瘤细胞内ER的表达显著减少(P＜0.01)、ER与ERE的结合量显著降低(P＜0.01).结论:一定剂量的MLT能显著抑制E2诱发的SD大鼠垂体PRL瘤的增生,其作用机制之一可能与MLT抑制ER的表达、及其部分阻断ER与ERE的结合有关.
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生殖系统雌激素受体的研究进展
雌激素受体(ER)是一种能与雌激素(E)特异性结合的糖蛋白,广泛分布于体内多个器官与组织中,其中生殖系统被认为是E作用的经典靶组织.研究ER的结构特征与信号传导机制、在生殖系统的分布、基因敲除的动物模型以及在生殖系统肿瘤中表达的意义,可以进一步阐明E的作用机制及生理效应.
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大豆苷元对人成骨细胞经典的雌激素受体信号通路的调节作用
[目的]研究大豆苷元对人成骨细胞经典的雌激素受体(estrogen receptor,ER)信号通路的调节作用.[方法]以同时表达两种ER亚型的人MG-63成骨样细胞为研究模型,分别应用不同终浓度的大豆苷元(0.01、0.1、1μmol/L)、雌二醇(0.1μmol/L)、雷洛昔芬(0.1 μmol/L)或二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)处理,通过荧光素酶报告基因、RT-PCR及免疫印迹等技术,观察大豆苷元对MG-63细胞经典的雌激素反应元件(estrogen response element,ERE)的基因转录活性、ER亚型及其相关的类固醇受体共激活因子(steroid receptor coactivator,SRC-1)表达的调节作用.[结果]大豆苷元可增强MG-63细胞经典的ERE基因转录活性,同时使其ERα、ERβ及SRC-1表达水平升高.[结论]大豆苷元可通过ER经典的基因组作用机制,即增强ERE基因转录活性对成骨细胞发挥效应,其机制可能与其增加ERα、ERβ及其相关的共激活因子SRC-1的表达水平相关.
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葛根素对人成骨细胞经典的ERE基因转录途径的调控作用
[目的]研究葛根素对人成骨细胞经典的雌激素反应元件(estrogen response element,ERE)基因转录途径的调控作用.[方法]将人成骨样MG-63细胞分为5组,分别加入不同终浓度的葛根素(0.01、0.1、1μmol/L)、雌二醇0.1 μunol/L或二甲基亚砜处理,通过荧光素酶报告基因检测、RT-PCR及Western blotting等方法,研究葛根素对人成骨细胞经典的ERE基因转录途径、雌激素受体(estrogen receptor,ER)亚型及p160家族共激活因子表达的调控作用.[结果]葛根素可促进人成骨细胞经典的ERE通路的活化,并上调其ERα、ERβ及类固醇受体共激活因子(steroid receptor coactivator,SRC)-1表达水平.[结论]葛根素可通过经典的基因组作用机制即ERE基因转录途径对成骨细胞发挥作用,其作用可能与其上调ERα、ERβ及SRC-1共激活因子的表达有关.
关键词： 葛根素 人成骨细胞 雌激素反应元件 雌激素受体 类固醇受体共激活因子-1 -
基于ERC-PCR的环境内分泌干扰物检测体系研究
目的 利用雌激素与雌激素受体α(estrogen receptor α,Erα)间基于配体受体激活效应的生物学原理和探针的定量PCR扩增-实时荧光检测技术,建立痕量环境内分泌干扰物(endocrine disrupting compounds,EDCs)的快速检测体系.方法 以2条含雌激素反应元件(estrogen response elements,ERE)并与Erα有高亲和力的DNA序列COX7RP-ERE和VitA2-ERE,作为结合探针,进行Erα体外受体.配体特异结合,形成配体-Erα-DNA探针复合体(Erα-DNA probe com-plex,ERC),荧光定量检测ERE含量,并考察17β-雌二醇(E_2)、雌酮(E_1)、己烯雌酚(DES)及邻苯二甲酸二甲酯(DMP)的结合情况.结果 与VitA2-ERE相比,人源性COX7RP-ERE在Erα体外受体-配体结合过程中具有更好的结合效应;E_1、E_2、DES、DMP 4种雌激素类化合物对COX7RP-ERE的结合存在明显的剂量-效应关系,其对COX7RP-ERE结合效应的半数有效浓度(EC_(50))分别为0.89 nmol/L、19.9 pmol/L、0.79 nmol/L、6.31 pmol/L.结论 检测体系中结合探针的结合量存在明显的雌激素剂量依赖性,这种基于Erα激活效应的ERC-PCR定量检测体系可以用于监测化合物和EDCs的类雌激素活性.
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修饰hTERT核心启动子靶向转录FCY1的重组腺病毒的构建及鉴定
目的: 构建并鉴定雌激素反应元件与缺氧反应元件共修饰人端粒酶逆转录酶(hTERT)核心启动子靶向转录酵母胞嘧啶脱氨酶(FCY1)的复制缺陷型重组腺病毒.方法: 构建由雌激素反应元件(ERE)和缺氧反应元件(HRE)串联重复序列共修饰的hTERT核心启动子,将该启动子序列与酵母胞嘧啶脱氨酶(FCY1)基因插入穿梭质粒,用穿梭质粒与辅助质粒共转染HEK 293细胞,获得重组腺病毒载体Ad-EHhT-FCY1,经 PCR鉴定证实后,采用终点稀释试验测定病毒滴度. 结果: 经24HRE与8ERE共修饰的hTERT核心启动子序列经正反向测序均正确;穿梭质粒和辅助质粒共转染的HEK 293细胞,在转染后7～10 d出现了典型的细胞病变反应(CPE), PCR反应能扩增出122bp的目的片段,终点稀释试验测定得到的病毒滴度为6.2×107 pfu*mL-1. 结论: 成功构建并获得高滴度的ERE与HRE串联重复序列共修饰的hTERT核心启动子引导FCY1转录的复制缺陷型重组腺病毒.
