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缺氧反应元件增强单纯疱疹病毒胸苷激酶/GCV对乏氧环境Ewing肉瘤细胞杀伤作用的研究
目的 构建一种由缺氧反应元件(hypoxia responsive element,HRE)调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-TK)基因的真核表达载体,观察HRE能否增强HSV-TK/GCV(gancyclovir,GCV)系统对乏氧环境中的人Ewing's肉瘤细胞系SK-ES细胞的杀伤作用,为弥补放、化疗的不足,探索有效的治疗方法.方法 (1)将合成的HRE片断,插入到pIRES2-EGFP(pIRES2-EGFP)的双顺反子荧光蛋白报告基因的真核启动子的增强子部位,获得重组质粒pHRE;以PCR法扩增HSV-TK基因中TK基因片断,将其克隆到pIRES2-EGFP及pHRE的双顺反子荧光蛋白报告基因上游的多克隆位点,获得重组质粒pTK及pHRE-TK.(2)通过脂质体将pHRE-TK、pHRE、pTK及pIRES2-EGFP导入SK-ES细胞,分别在乏氧(O2浓度为3%)和富氧(O2浓度为21%)环境中培养,荧光显微镜观察报告基因增强性绿色荧光蛋白表达变化,并进行荧光吸光度分析;再予以GCV处理5 d后,用MTF法检测GCV对培养细胞的杀伤效果.结果 (1)测序结果证实,重组质粒pHRE含HRE片断,pTK及pHRE-TK含HSV-TK片断,均为单拷贝正向插入,序列正确.(2)对比各组细胞EGFP荧光吸光度值发现:①在乏氧环境中培养,pHRE和pHRE-TK组细胞荧光吸光度值高于在富氧环境培养的荧光吸光度值(P＜0.01);②在乏氧环境培养,pHRE组和pHRE-TK组细胞荧光吸光度值高于pTK组和pIRES2-EGFP组(P＜0.01);③在富氧环境培养的各组细胞之间荧光吸光度值差异无统计学意义(P＞0.05).(3)对比GCV对各组细胞杀伤效果发现:①在乏氧、富氧两种环境培养的pHRE-TK和pTK组细胞对GCV的敏感性均高于pHRE组细胞(P＜0.01),敏感性随GCV浓度增加而增大;②在乏氧环境培养的pHRE-TK组细胞对GCV的敏感性高于pTK组(P＜0.01),而在富氧环境中培养的pHRE-TK组与pTK组细胞对GCV的敏感性差异无统计学意义(P＞0.05);③在乏氧环境培养的pHRE-TK组细胞对GCV的敏感性高于在富氧环境中培养的pHRE-TK组细胞(P＜0.01);而在乏氧、富氧两种环境培养的pTK组细胞对GCV的敏感性差异无统计学意义(P＞0.05).结论 (1)成功地构建了含有HRE及HSV-TK基因片断的真核表达载体.(2)在缺氧的SK-ES细胞内,HRE使报告基因EGFP表达增强.(3)HRE能增强HSV-TK/GCV系统对乏氧环境中的SK-ES细胞的杀伤效率.
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缺氧诱导因子1α相关信号通路与肿瘤关系的研究进展
缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是细胞缺氧应激状态下活跃的细胞因子,其表达及活性受脯氨酰羟化酶(PHD)/希佩尔林道蛋白(pVHL)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、细胞外信号调节激酶(ERK)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Bcl-2相关性抗凋亡基因3(BAG3)/热激蛋白70(HSP70)等上游信号通路的调节,并通过特异性识别结合靶基因缺氧反应元件区域,调节其下游靶基因表达,在肿瘤发生过程中起重要作用.
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低氧诱导因子-1与其靶基因
低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)首先是1992年Semenza对经缺氧处理的Hep3B和HepG2细胞株的核提取物进行电泳位移分析时发现的[1].HIE-1是细胞在缺氧条件产生的核蛋白,它与靶基因结合,促进其转录,使机体产生一系列缺氧适应反应.
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缺氧诱导因子-1与肿瘤治疗研究进展
肿瘤的缺氧状态可诱导促进血管形成的多种细胞因子释放,由此增进肿瘤的生长和转移.近来在缺氧肿瘤生物学行为方面的研究取得了很大进展.缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子.HIF-1可调节多种靶基因如血管内皮生长因子(VEGF)、红细胞生成素(EPO)等的表达.HIF-1广泛存在于动物及人体的多种肿瘤细胞中,其活性在维持肿瘤细胞的能量代谢、新生血管形成,以及促进肿瘤增殖和转移中起重要作用.研究HIF-1与肿瘤的关系为肿瘤治疗提供了新的思路和途径.
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缺氧对HRE-TK/GCV系统杀伤骨肉瘤细胞的增强作用
目的:探讨缺氧条件下,缺氧反应元件启动子-胸苷激酶/丙氧鸟苷(HRE-TK/GCV)系统对骨肉瘤细胞系MG63靶向性杀伤作用.方法:构建由HRE启动子驱动的含潮霉素磷酸转移酶-单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Hygromycin phosphotransferase-thymidine kinase,HyTK)融合基因的真核表达质粒pBI-HRE-HyTK,并将其转染入骨肉瘤细胞系MG63.应用PCR和RT-PCR方法检测TK基因的整合及表达;用MTT法和混合共培养实验分别检测转基因细胞在缺氧或不缺氧状态下对GCV的敏感性以及HRE-TK/GCV系统的"旁观者效应";流式细胞仪检测细胞周期改变及电镜观察细胞超微结构变化探讨其作用机制.结果:成功构建了真核表达质粒pBI-HRE-HyTK,得到转基因细胞系MG63TK.检测到MG63TK细胞内TK基因的DNA和mRNA.MG63TK细胞在不缺氧状态下对GCV不敏感,当GCV浓度达50μg/ml时,仅30%左右细胞被杀死;而缺氧状态下,GCV浓度1μg/ml时,50%左右细胞被杀死,GCV浓度50μg/ml时,90%以上细胞被杀死.混合共培养实验中,缺氧状态下,HRE-TK/GCV系统旁观者效应明显增强,MG63细胞存活率显著低于不缺氧状态下.缺氧和GCV共同作用使转基因细胞DNA合成抑制,细胞周期阻滞于G0G1期,细胞发生凋亡和坏死.结论:缺氧可以增强HRE-TK/GCV系统对体外培养骨肉瘤细胞系选择性的杀伤作用和旁观者效应,该系统为骨肉瘤靶向性基因治疗提供了新的有效途径.
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缺氧反应元件同肿瘤治疗的研究进展
研究表明,在肿瘤适应低氧过程中缺氧诱导因子(HIF)起着中枢纽带作用,HIF是肿瘤适应低氧,产生一系列低氧行为的中心环节,而近研究发现,缺氧反应元件( hypoxia response elements,HRE)是介导细胞低氧反应的重要调控序列,HRE是一种缺氧敏感诱导性调控元件,在实体瘤内的活性较高[1],在肿瘤细胞生长、浸润及转移等过程中发挥着重要的作用.HIF-1α在核内作为转录因子与相关基因启动子中的乏氧反应元件相互作用,激活基因表达.据此,通过基因工程技术,在相关基因的启动子中插入HRE就能使该基因选择性地在乏氧情况下表达,构建对放、化疗敏感的真核载体转染肿瘤细胞,使乏氧肿瘤细胞在表达乏氧基因的同时表达该基因,从而形成了乏氧介导的特异性肿瘤治疗系统,提高了肿瘤的治疗效果.由于HRE及HIF-1α靶向基因治疗具有特异性强、不良反应小和疗效可靠等特点,已成为现代肿瘤治疗学新的研究重点.下面就近年来缺氧反应元件同肿瘤放化疗及基因治疗的相关研究进展作一综述.
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慢病毒介导的HRE-VEGF基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究
目的:通过慢病毒系统将HRE-VEGF整合基因转染至MSCs细胞,评价该新型MSCs用于缺血性心肌病的治疗的可行性. 方法:运用同尾酶法构建9拷贝缺氧反应元件,并构建9HRE-VEGF表达载体.使用慢病毒系统将目的基因9HRE-VEGF转染干细胞建立转基因MSCs,检测其在不同缺氧、复氧时间VEGF的表达. 结果:慢病毒系统转染MSCs具有较高的转染效率,成功构建了整合有9HRE-VEGF的新型转基因MSCs,在低氧下表达VEGF,而在常氧状态下VEGF表达关闭. 结论:HRE对转导的VEGF基因表达具有调控作用,缺氧状态下VEGF稳定表达,此低氧诱导调控方式将更有利于缺血性心脏疾病的治疗.
关键词： 骨髓间充质干细胞 血管内皮细胞生长因子 缺氧反应元件 基因治疗 -
Canstatin分泌增强体系的建立及其抗肺癌作用
目的:评估canstatin分泌增强体系在不同氧条件下的生物学效应,观察其对裸鼠肺癌模型的抗肿瘤作用.方法:基因重组技术构建canstatin分泌型载体,将其转染肿瘤细胞观察其在不同氧条件下的 canstatin mRNA表达量,稳定转染的肺癌细胞与人脐静脉内皮细胞混合培养,观察混合培养对内皮细胞增殖、凋亡的效应.建立裸鼠肺癌移植瘤模型,将此体系转染荷瘤裸鼠,观察其对裸鼠移植瘤血管生成的作用,及肿瘤体积重量等指标,评估其抗肺癌效果.结果:成功构建canstatin缺氧增强分泌体系.缺氧条件下其转染的肺腺癌A549细胞canstatin mR-NA的表达显著增加.其稳定转染的A549细胞与人脐静脉内皮细胞HUVEC混合培养可使HUVEC生长增殖缓慢并大量凋亡,此体系转染的裸鼠移植瘤生长缓慢,瘤重、瘤体积及血管生成均显著低于对照组.(P＜0.01).结论:canstatin分泌增强体系在缺氧条件下能显著增加目的基因表达量及其生物学效应,并具有显著抑制肺癌生长和血管生成的作用.
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缺氧诱导的肝癌靶向性基因治疗载体的构建和检测
目的:构建缺氧诱导的AFP基因启动子(HRE-AFPp)调控的基因表达载体,并检测该调控元件的特异性和对缺氧诱导的反应性.方法:用PCR方法从人类基因组中扩增VEGF基因缺氧反应元件(HRE)和AFP基因启动子(AFPp),将上述片段与含有报告基因(强化绿色荧光蛋白基因)载体pEGFP-1的多克隆位点连接,构建成为缺氧诱导的AFP基因启动子调控的基因表达载体(pEGFP-[HRE]AFPp).用脂质体法将表达载体转染表达或不表达AFP的细胞系,G418筛选阳性克隆,荧光显微镜观测重组AFPp的活性,并用流式细胞术检测缺氧诱导是否对其有调控作用.结果:成功地将HRE、AFPp克隆到报告基因载体pEGFP-1的多克隆位点,酶切鉴定和DNA序列分析无误,荧光显微镜观测证实EGFP能在AFP阳性肝癌细胞特异性表达,流式细胞术检测证实,16 h缺氧诱导能增强EGFP的表达(P＜0.01).结论:缺氧诱导的AFP顺式作用元件修饰的基因治疗载体,在基因转录水平特异性调控目的基因的表达,为下一步将其作为肝癌基因治疗载体奠定了基础.
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缺氧诱导因子-1--肿瘤治疗的新靶点
肿瘤细胞的失控生长容易产生肿瘤内缺氧微环境,进而诱导缺氧诱导因子1(HIF-1)的形成.HIF-1为一异源二聚体转录因子,在多种肿瘤中广泛存在,且受多种因素调节.它与一系列缺氧反应靶基因上的特定结合位点缺氧反应元件(HRE)结合,从而启动靶基因的转录表达,同肿瘤的增殖、转移密切相关.以HIF-1为靶点可能为肿瘤治疗提供一新的策略.
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携带mda7/IL24的三调控增殖腺病毒治疗肝癌的体外实验
目的:构建缺失E1A区24 bp,由端粒酶反转录酶基因启动子和缺氧基因启动子调控的增殖腺病毒SG600-IL24,研究人白细胞介素24(interleukin 24,IL24)在肝癌细胞内的表达水平和SG600-IL24的增殖情况及其对肝癌细胞的杀伤作用.方法:利用DNA克隆和重组技术,构建SG600-IL24.ELISA检测1124在肝癌细胞SMMC-7721、BEL-7404和正常成纤维细胞BJ内的表达.半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infectious dose,TCID50)法检测SG600-IL24在3种细胞内48和96 h的增殖情况.MTT法和细胞病理效应(cytopathic effect,CPE)染色法检测SG600-IL24在不同MOI值对3种细胞的杀伤作用.结果:IL24在SMMC-7721和BEL-7404细胞内高表达而在BJ细胞内低表达.感染48和96 h后,SG600-IL24在SMMC-7721、BEL-7404和BJ细胞内分别增殖794和7940倍、622和7810倍、20和200倍.MTT结果显示,杀伤50%和90%的SMMC-7721、BEL-7404和BJ细胞所需SG600-IL24的MOI值分别为0.3和5,3和20,50和150.CPE染色显示,SG600-IL24对肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7404有明显杀伤作用,而对BJ细胞无明显影响,并且该病毒的杀伤能力比增殖腺病毒ZD55-1124和非增殖腺病毒Ad-IL24强.结论:SG600-IL24高效感染肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7404后,病毒增殖活跃,IL24的表达量显著升高.SG600-IL24对此2种肝癌细胞有良好的特异性杀伤作用,而对正常细胞没有明显影响,为应用该病毒治疗肝癌的体内研究建立了基础.
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人肝癌细胞中缺氧反应元件对微环境的反应
目的:通过观察缺氧反应元件(hypoxia-response element,HRE)调控下,绿色荧光蛋白质(green fluorescent protein,GFP)构建的肝癌细胞Bel-7402/5HRE-EGFP在缺氧条件下,缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等表达水平的变化,研究HRE对微环境的反应特性.方法:以5个串连的HRE和巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)的微小启动子为转录调控元件、GFP为报告基因构建表达载体,应用FCM和细胞免疫染色法观察缺氧、一氧化氮、过氧化物和酸性pH等微环境的变化对人肝癌细胞Bel-7402中HRE活性的影响,以及缺氧条件下HIF-1α、VEGF表达水平的变化.观察缺氧探针哌莫硝唑的染色强度和分布与HIF-1α、VEGF和GFP表达强度和分布之间的关系,探求裸鼠体内肿瘤组织缺氧对HRE活性及其相关基因表达的影响.结果:肝癌细胞中HRE对缺氧非常敏感,肿瘤细胞和组织缺氧时可上调HIF-1α和VEGF的表达,两者的分布也基本一致.结论:缺氧在调控肝癌血管生成因子表达方面可能起着重要的作用.
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缺氧诱导因子1与脑缺血
神经细胞缺血、缺氧时,缺氧诱导因子1产生并处于缺氧应答的关键环节,通过作用于靶基因的缺氧反应元件调控相关基因的表达,在脑缺血后神经细胞凋亡及血管生成等方面起重要作用,并将成为脑血管病基因治疗研究的新方向.
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缺氧诱导因子与肾细胞癌
缺氧诱导因子 (hypoxia inducible factor, HIF)是由Semenza等于1992年在缺氧诱导的细胞核提取物中发现的,缺氧的条件下广泛存在于哺乳动物人体细胞.HIF在大多数肾细胞癌中过度表达,其活性对维持肾细胞癌的能量代谢新血管的形成,促进肾细胞癌生长和转移起重要作用,且受多种因子调节.本文主要论述HIF-α的结构与调节及其在肾细胞癌发生发展中的作用.
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缺氧诱导因子-2α与MMP-2启动子结合位点的确定
目的 探讨缺氧诱导因子-2α (hypoxia inducible factor-2α, HIF-2α)与基质金属蛋白酶-2 (matrixmetallo proteinases-2, MMP-2)基因中缺氧反应元件(hypoxia-response element, HRE)的体外结合,并确定该结合位点.方法 采用凝胶滞留电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)鉴定HIF-2α与MMP-2基因中HRE的体外结合;同时利用染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)进一步验证并确定该结合位点.结果 成功预测2条MMP-2启动子区潜在的HIF-2α结合位点,分别为-217 ～-204、-1 029～-1 007;探针标记效率检测结果显示,正义链和反义链标记效率均为50％以上,可用于EMSA实验;结果显示,MMP-2启动子区存在HIF-2α的结合位点,位于-217 ～-204.CHIP结果显示,实验组和对照组均扩增出约bp MMP-2启动子中含HRE区域的片段,提示HIF-2α蛋白与MMP-2启动子中的HRE区域存在活体内结合的关系.结论 HIF-2α与MMP-2基因中的HRE存在体内外结合.
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基因-病毒治疗系统CNHK500-p53的构建和体外初步研究
目的 构建一种新的基因-病毒治疗系统.方法 通过基因操作技术将目的基因表达盒mCMV启动子+p53基因+SV40polyA插入腺病毒E1A基因受端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控、E1B基因受缺氧反应元件(HRE)启动子调控的增殖病毒载体质粒pSG500的E1 A下游,得到腺病毒质粒pSG500-p53;通过pSG500-p53与5型腺病毒右臂的质粒pBHGE3在293细胞中同源重组得到重组病毒CNHK500-p53;利用Western blot和ELISA法检测病毒E1A、E1B基因和p53抑癌基因的表达;TCID50方法测定病毒滴度;通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力;应用细胞病理效应(CPE)实验检测病毒抗肿瘤作用.结果 CNHK500-p53的病毒滴度为2×1010 pfu/ml,增殖实验证实CNHK500-p53可以选择性地在端粒酶阳性和缺氧微环境的肝癌细胞中增殖,CNHK500-p53所携带的p53基因在肝癌细胞株中的表达量388±34.6μg/L明显高于非增殖型腺病毒载体Ad-p53的76.3±13.17μg/L(P＜0.005),并显示了较强的抗肿瘤效应.结论 CNHK500-p53是一种具备治疗肝癌潜力的新型基因-病毒治疗系统.
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以缺氧诱导因子-1为靶点的肿瘤治疗展望
机体内环境中氧的稳定对有机体的发育和生理来说非常重要.缺氧是肿瘤迅速生长和转移的共同特征.适应缺氧吮匦璧拇蠖嗍鞍椎牡骺卦诨蛩?其通过结合一个转录因子--缺氧诱导因子-1(HIF-1)调控,HIF-1保市蜇列--5'-ACGTG-3'存在于调控基因缺氧反应元件(HRE)中[1].
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双重调控选择增殖型腺病毒CNHK500的构建及初步研究
目的研制出一种双重调控的选择增殖型腺病毒载体系统.方法先后经2次定点突变重叠聚合酶链反应(PCR)技术使腺病毒E1A及E1B启动子缺失,并将人工合成的人端粒酶逆转录酶启动子和缺氧反应启动子分别插入E1A及E1B基因的上游,得到腺病毒载体质粒pSG500.通过pSG500与质粒phGE3在293细胞中同源重组得到重组病毒ChK500.扩增、纯化病毒,用TCID50方法测病毒滴度.通过病毒增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力.结果成功构建了由双重调控选择增殖型腺病毒ChK500,病毒滴度为1.9×10 10 pfu/ml,增殖实验结果证实ChK500可以选择性地在端粒酶阳性肿瘤中增殖.结论 ChK500为肿瘤的生物治疗提供了一种新的策略.
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缺氧特异性调控基因表达在缺血性卒中治疗中的研究进展
在缺血性卒中的基因治疗过程中，外源基因的过表达可能会引起不良副作用，利用缺氧特异性调控的基因表达可以分别从转录、转录后及翻译后水平对外源基因的表达进行缺氧特异性调控，使外源基因在缺氧的条件下高表达，而在常氧条件下低表达甚至不表达。这一基因表达调控系统可以为缺血性卒中提供新的治疗策略。
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缺氧/辐射双敏感性启动子调控CD/UPRT融合自杀基因在Hep-2细胞表达的实验研究
目的 本研究拟构建缺氧/辐射双敏感性启动子,观察其在缺氧或放射诱导下调控CD/UPRT基因在喉癌Hep-2细胞的表达水平,为探索新的喉癌基因-放射治疗奠定实验基础.方法 利用基因重组技术构建嵌合启动子HRE1.Egr-1调控CD/UPRT基因表达的质粒表达载体;脂质体介导重组质粒转染喉癌Hep-2细胞,分为对照组、放射组(2、4、6、8 Gy)、缺氧组(1%、2%、3% O2浓度)及放射加缺氧组(8 Gy+3% O2),Western-blotting法检测转染细胞中CD/UPRT表达.结果 对照组细胞仅可检测到CD/UPRT的低水平表达,放射组蛋白表达的相对灰度值分别为1.3、1.6、1.8、2.9,缺氧组CD/UPRT基因表达相对灰度值分别为1.5、2.0、2.2,放射合并缺氧组CD/UPRT表达显著高于放射组或者缺氧组(P＜0.01).结论 HRE1.Egr-1启动子具有辐射/缺氧双重敏感性,并使放射干预后的Hep-2细胞CD/UPRT表达水平在缺氧下得到显著增强,为喉癌的基因-放射治疗开辟了新思路.
