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转染碱性成纤维细胞生长因子基因在成肌细胞中表达及调控系统的建立
背景:作者前期研究已经成功将碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast grouth factor,bFGF)基因转入鼠眼外肌的肌卫星细胞中,证明其能够在眼外肌的成肌细胞中表达并促进细胞增殖,促进其分化能力.目的:进一步探讨转染后碱性成纤维细胞生长因子基因在成肌细胞中表达的调控方法.方法:将目的基因碱性成纤维细胞生长因子与诱导表达载体pcDNA4/TO/myc-HisTMA连接,通过经菌落PCR和酶切鉴定的阳性克隆测序和EcoR I and Hind III双酶切处理和Xho I单酶切处理验证.筛选并确定C2C12成肌细胞的抗生素的敏感性.通过脂质体转染技术,建立C2C12稳定表达pcDNA6/TR细胞系,经Western blot(蛋白印迹法)鉴定.将pcDNA4/TO/myc-孙HisTMA-bFGF转染到pcDNA6/TR-C2C12细胞系,免疫荧光法及Western blot法检测碱性成纤维细胞生长因子在四环素诱导的转染了pcDNA4/TO/myc-HisTMA-bFGF的C2C12细胞内的表达及其分泌情况,并设对照.结果与结论:①经测序对照,双酶及单酶切处理均证实碱性成纤维细胞生长因子与诱导表达载体pcDNA4/TO/myc-HisTMA成功连接.②blasticidin对C2C12细胞的小致死浓度为10 mg/L,zeocin对C2C12细胞的小致死质量浓度为750 mg/L.③建立的pcDNA6/TR-C2C12细胞系正确.④经四环素处理的转染了pcDNA4/TO/myc-HisTMA-bFGF的成肌细胞基因表达阳性,未经处理的则为阴性;经四环素处理的转染了pcDNA4/TO/myc-HisTMA-bFGF的成肌细胞产生碱性成纤维细胞生长因子蛋白,24 h达高峰,未处理的则不能产生碱性成纤维细胞生长因子蛋白.结果提示应用四环素抑制调节系统,可以调节碱性成纤维细胞生长因子基因在成肌细胞中的表达.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 基因 转染 调节 成肌细胞 -
人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰成肌细胞移植心肌梗死大鼠心肌细胞胰岛素样生长因子Ⅰ及端粒酶反转录酶mRNA的表达
目的:检测人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞移植后,心肌梗死大鼠血浆及心肌组织内胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白浓度的变化,以及心肌细胞内胰岛素样生长因子Ⅰ和端粒酶反转录酶mRNA水平的表达.方法:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞、未转染的止常鼠骨骼肌成肌细胞均由实验室前期制各.健康雄性SD大鼠90只,取12只作为假于术组,剩余大鼠结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,结扎后24 h存活36只,随机分为对照组和实验组,18只/组.造模后24 h.实验组在动物后肢局部分多点注射总量为0.1 mL的人胰岛素样生长因子Ⅰ基闪修饰的鼠骨骼肌成肌细胞悬液.(2～4)×1010L-1细胞;对照组和假手术组给予等量未转染的正常鼠骨骼肌成肌细胞悬液.应用ELISA法检测血浆和心肌组织胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,RT-PCR检测心肌细胞中胰岛素样生长因子Ⅰ与端粒酶反转录酶mRNA水平.结果:①细胞移植后1,2,4周,假手术组血浆和心肌组织内鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的表达无明显变化(P>0.05);与假手术组比较,实验组和对照组血浆中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的质量浓度均显著降低(P<0.01),心肌组织中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的含量均明显升高,于第2周达峰值(P<0.01),且实验组较对照组升高更为显著(P<0.01).②细胞移植后1,2,4周,假手术组和对照组大鼠血浆和心肌组织内均未检测到人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达:实验组于第1周即表达人胰岛素样生长因子Ⅰ,含量显著高于其余两组(P<0.01).③细胞移植后第1周,实验组和对照组心肌细胞鼠胰岛素样生长因子1mRNA相对表达量明显高于假于术组(P<0.01):至第2周实验组达峰值,显著高于对照组(P<0.01),然后逐步下降.实验组和对照组心肌细胞端粒酶反转录酶mRNA的表达均逐渐呈升高趋势,且实验组更为显著(P<0.01).结论:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞植入心肌梗死大鼠体内1周后,能有效合成和分泌胰岛素样生长因子Ⅰ,明显促进心肌梗死早期大鼠心肌细胞鼠胰岛素样生长因子Ⅰ及端粒酶反转录酶mRNA的表达,同时可持续促进心肌及全身其他组织鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的分泌.
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稳定表达人降钙素基因大鼠成肌细胞株的建立
目的:建立稳定表达人降钙素(hCT)基因的细胞株(L6),观察人降钙素基因在大鼠成肌细胞中的表达和分泌情况.方法:实验于2004-06/2005-11在河南省肿瘤病理重点实验室完成.用已构建的5'端融合小鼠抗体轻链基因lgκ的信号肽序列的人降钙素基因分泌性真核表达载体pCDNA3.0-lgκ-hCT,采用脂质体介导方法将人降钙素基因导入大鼠成肌细胞;对照组用pCDNA3.0空质粒转染.经G418筛选后,用反转录-聚合酶链反应法和免疫细胞化学法检测人降钙素基因在大鼠成肌细胞中的表达,并用放免法检测细胞培养上清液降钙素的分泌.结果:①反转录-聚合酶链反应法检测人降钙素基因的表达:反转录-聚合酶链反应扩增后,重组质粒载体转染组成肌细胞总RNA中检测到人降钙素基因的表达,而空载体转染组和未转染成肌细胞均未检测出目的基因(210 bp);β-肌动蛋白为内对照约385 bp.②免疫细胞化学法测定降钙素的表达:pCDNA3.0-lgκ-hCT转染组成肌细胞浆被黄染,提示有人降钙素表达;而空载体组胞浆染色阴性,无人降钙素表达.③细胞培养上清液中降钙素的含量:pCDNA3.0-lgκ-hCT重组载体转染组(hCT)1～10代细胞培养上清液人降钙素浓度差异无显著性(P＞0.05),明显高于同代空载体转染组(pCDNA3.0)(P＜0.001).结论:稳定表达人降钙素基因的大鼠成肌细胞株成功建立,为进一步体内移植治疗骨质疏松症打下基础.
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低氧促进大鼠骨骼肌成肌细胞体外增殖及重金属钴的作用
目的:观察低氧促进大鼠骨骼肌成肌细胞增殖的作用,并分析CoCl2对成肌细胞增殖的影响.方法:实验于2005-05/2006-07在解放军军事医学科学院基础医学研究所神经肌肉发育研究室完成.①低氧CO2温箱(Forma Scientific,美国);CoCl2(北京化工厂).②选取4～5周龄Wistar雄性大鼠5只,脱颈处死无菌切取后腿肌群,剪除脂肪和筋膜,制备单细胞悬液.以连续贴壁法筛选大鼠骨骼肌成肌细胞,接种于96孔板进行单克隆培养.采用成肌细胞特异性标志抗原desmin免疫化学染色,鉴定成肌细胞标志蛋白--结蛋白的表达,弃去desmin阴性的细胞克隆,继续培养desmin阳性的细胞克隆,隔天换液1次,7 d进行酶消化传代,获得大量扩增的细胞,并可冻存复苏,用于实验.③以1×107 L-1接种于20个35 mm培养皿中,接种细胞3 h后,将培养皿随机数字表法分为5组:常氧对照组、轻度低氧组、中度低氧组、CoCl2组、轻度低氧+CoCl2组,4皿/组.常氧对照组置于体积分数为0.2的O2常规氧气环境中;轻、中度低氧组分别于低氧温箱中维持体积分数为0.1与0.03的O2低氧环境中;CoCl2组向培养皿中加入终浓度为15 μmol/L的CoCl2;轻度低氧+CoCl2组向细胞培养皿中加入终浓度为15 μmol/L的CoCl2后,放入体积分数为0.1的O2低氧温箱.低氧培养24,48,72 h时,各组取出培养皿进行细胞消化离心,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,血球计数板计数法进行细胞计数.④以1×108 L-1接种于8个60 mm培养皿中,接种细胞3 h后,将培养皿随机数字表法分为2组:常氧对照组、轻度低氧组,4皿/组.两组干预措施同细胞计数过程.低氧培养48 h时,两组取出培养皿进行细胞消化离心,流式细胞仪检测细胞周期.结果:①骨骼肌成肌细胞的单克隆培养结果:成肌细胞可在体外存活6个月,增殖旺盛期约为3个月,可传代15次以上.单克隆培养2周后,可以由单个细胞长满96孔板中的1个孔,并不断扩增,终可以得到细胞类型专一单克隆化的成肌细胞.②成肌细胞特异性标志抗原desmin鉴定结果:镜下不同视野desmin阳性率达100%,即培养的成肌细胞单克隆纯度达100%.③细胞计数结果:与常氧对照组比较,低氧培养24,48,72 h时轻、中度低氧组均可明显促进大鼠骨骼肌成肌细胞体外增殖,且轻度低氧组作用尤为明显(t=4.98,P＜0.001);CoCl2组无明显变化,但轻度低氧+CoCl2组细胞数量显著增加(t=4.62,P＜0.001).④细胞周期分布:与常氧对照组比较,低氧48 h时轻度低氧组处于S期的细胞明显增多[(26.67±0.89)%,(65.43±0.23)%,t=2.36,P＜0.01],且增殖指数亦显著上升(33.4%,67.1%,t=2.15,P＜0.01).结论:①轻中度低氧可以促进大鼠骨骼肌成肌细胞的增殖,为体外大量扩增细胞提供了新思路.②CoCl2对骨骼肌成肌细胞没有促增殖作用.
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p38MAPK信号通路与应力介导成肌细胞的凋亡
背景:在体内条件下,细胞力学的功能研究因其所处生理环境的复杂性、实验条件的不易控制而很难得到满意结果.目的:在成功构建成肌细胞体外培养-力学刺激模型的基础上,研究p38MAPK信号通路在成肌细胞凋亡中的作用及其机制.方法:将体外培养的C2C12细胞分为对照组和SB203580组,SB203580组中加入 20 mmol/L的p38MAPK抑制剂SB203580.应用细胞应力加载装置Flecell Strain Unit-5000T给细胞提供15%的力值,分别施加0,6,12,24 h的周期性张应力.每分钟10个循环,每循环包括3 s牵张,3 s松弛.Hoechst 33258染色观察细胞的形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;RT-PCR法检测促凋亡基因bax mRNA的表达;Western blot检测信号通路中p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表达.结果与结论:随着加力时间的延长,细胞逐渐出现核固缩及凋亡小体,凋亡率增加(P < 0.05),bax mRNA表达增多(P < 0.05);细胞p38MAPK和p-p38MAPK蛋白均在加力6 h达到低,此后逐渐升高.p38MAPK抑制剂SB203580可抑制加力引起的细胞凋亡,减少bax mRNA及p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表达(P < 0.05).说明p38MAPK信号通路在应力介导的成肌细胞凋亡中起到重要的作用.
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人生长激素基因修饰成肌细胞移植对心肌梗死细胞凋亡及心功能的影响
背景:骨骼肌细胞移植于损伤心肌可以改善心脏功能,但大部分细胞在移植早期因损伤心肌的缺血及炎性氧化应激环境而发生死亡.研究证实通过细胞预处理或联合基因治疗可以改善移植细胞的生存.目的:探讨人生长激素基因修饰的成肌细胞移植对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡和心功能的影响.设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2007-05/2008 12在山西省长治医学院和华中科技大学同济医学院附属协和医院完成.材料:SD大鼠30只,随机分为3组:人生长激素组、绿色荧光蛋白组、模型对照组,10只,组.另取1-3 d龄SD乳鼠用于骨骼肌成肌细胞培养.pLghGHSN质粒、pLgGFPSN质粒由本实验室提供.方法:分别取携带人生长激素基因的pLghGHSN质粒和携带绿色荧光蛋白基因的对照质粒pLgGFPSN,用二步转染法转染E86和PT67包装细胞,G418筛选并扩增阳性克隆.各组大鼠均结扎左冠状动脉前降支制作心肌梗死模型,2周后人生长激素组将转染pLghGHSN的成肌细胞悬液150 μ L(含6×106个成肌细胞)分3点注射于心肌梗死区边缘,绿色荧光蛋白组同法注射等量转染pLgGFPSN的成肌细胞悬液,模型对照组沣射等体积无血清培养基.主要观察指标:细胞移植4周后,超声心动图和血流动力学检查各组心功能变化:苏木精一伊红染色检测心肌梗死面积,天狼星红染色检测胶原纤维容积分数:western blot法检测心肌组织Bax,Bcl-2,人生长激素和caspase3蛋白的表达.结果:与模型对照组比较,人生长激素组左室腔变小,左室游离壁厚度增加,左室舒张末期内径和左室收缩末期内径均显著减小(P<0.05),短轴缩短率显著增加(P<0.05).与绿色荧光蛋白组、模型对照组比较,人生长激素组大鼠左室压力大上升速率、左室压力大下降速率绝对值、左室收缩末压均显著升高(P<0.05),左室舒张末压显著降低(P<0.05):血清中类胰岛素样生长因子1质量浓度显著升高(P<0.05);心肌梗死面积明显减小(P<0.05);bax,caspase3蛋白表达水平降低,Bcl-2蛋白表达水平增加,人生长激素蛋白呈阳性表达.结论:人生长激素基因修饰的成肌细胞移植可以抑制心肌细胞凋亡,与单独成肌细胞移植相比能够更有效地缩小心肌梗死面积,更好地改善心肌梗死大鼠的心功能.
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重组人骨形成蛋白2诱导成肌细胞成骨分化中的矿化反应
背景:近年来成肌细胞在重组人骨形态发生蛋白2诱导下向成骨细胞分化已经通过多种方式得到了证实.目的:探讨成肌细胞在重组人骨形态发生蛋白2诱导下向成骨分化过程的矿化反应及其体外诱导表达成骨表型的可行性.方法:采用差速贴壁法和酶消化法获取Wistar乳鼠成肌细胞并体外培养,纯化鉴定后取第3代培养成肌细胞加入含重组人骨形成蛋白2的培养液进行诱导,对照组不加入重组人骨形成蛋白2,体外培养21 d.结果与结论:成肌细胞经重组人骨形成蛋白2诱导后,细胞增殖减缓,相邻细胞聚集呈层状排列,诱导8 d可见胞浆有少量不透光结节,诱导14 d结节增多,21 d时胞浆内可见大量不透光结节,未经重组人骨形成蛋白2诱导的成肌细胞融合成有收缩性的肌管.诱导后的成肌细胞碱性磷酸酶活性随时间延长而增强,诱导21 d时细胞经碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色和钙结节染色均呈阳性反应.表明大鼠成肌细胞经重组人骨形成蛋白2诱导可以出现矿化反应,可在体外一定条件下诱导能够转化为成骨细胞.
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核转录因子κB信号通路在应力调控成肌细胞分化中的作用
背景:NF-κB信号通路在细胞生长分化、炎症反应、肿瘤生长等过程中发挥重要的调节作用,也参与成肌细胞分化的调控.目的:分析NF-κB信号通路在应力介导的C2C12成肌细胞分化中的作用及其作用机制.方法:成功构建大鼠C2C12成肌细胞体外培养-力学刺激模型,采用多通道细胞牵张应力加载系统,以0.5 Hz的加载频率和10%的细胞拉伸变形幅度对细胞进行拉伸培养2,6,12,24 h.结果与结论:①C2C12成肌细胞在周期性机械拉伸力作用下,NF-κB信号通路被激活.当细胞受到应力刺激6 h后,胞核NF-κB p65亚基蛋白表达水平开始增强,24 h内NF-κB p65亚基蛋白表达水平达到峰值.加力12,24 h组与未加力对照组之间差异有显著性意义(P < 0.05).②IκBα蛋白表达水平在加力6 h后表达显著下降,24 h内IκBα蛋白表达水平减弱达到低.加力12,24 h组与未加力对照组之间差异有显著性意义(P < 0.05).③周期性张应力促进C2C12成肌细胞分化过程中Myogenin的表达,加入NF-κB信号通路特异性抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸 (20 μmol/L) 后再加力,Myogenin的表达明显降低.以上结果提示:①NF-κB信号通路可能参与应力介导的C2C12成肌细胞分化的调控过程.②当细胞受到应力刺激时,胞质IκBα发生磷酸化并降解.③NF-κB信号通路在应力介导的C2C12成肌细胞分化过程中发挥重要作用,但不是这一调控过程的惟一通路.
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氧化应激对C2C12成肌细胞增殖与凋亡的影响
目的:利用过氧化氢作为外源性活性氧来源,探讨氧化应激对C2C12成肌细胞增殖与凋亡的影响.方法:实验于2005-10/2006-01在广东省组织构建与检测重点实验室完成.C2C12成肌细胞(美国ATCC,批号CRL-1722TM);过氧化氢(汕头市光华化学药厂,批号20050519).①C2C12细胞置于含100 mg/L青霉素,100 mg/L链霉素和体积分数为0.1胎牛血清的DMEM-F12培养基中常规培养.②采用四甲基偶氮唑盐法测定过氧化氢对C2C12细胞增殖的影响.取体外培养的C2C12细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液,离心重悬,血细胞计数板进行细胞计数,细胞悬液密度为3.4×106 L-1,接种至96孔板,200 μL/孔.实验共分5组:过氧化氢25,50,100,300 μmol/L浓度组、空白对照组,6个平行孔/组.各组在37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱内常规培养.待细胞融合率达80%且未出现细胞分化时,过氧化氢各浓度组分别向C2C12细胞中加入含对应浓度过氧化氢的无血清培养基,空白对照组则向C2C12细胞中加入单纯无血清培养基.各组细胞分别于过氧化氢处理0,6,12,24,36,48,60 h后,每孔加入2 g/L的四甲基偶氮唑盐液20μL,于酶联免疫仪570 nm处检测各孔吸光度值.③过氧化氢对C2C12细胞凋亡的影响:采用Hoechst 33342/PI双染检测C2C12细胞凋亡.正常细胞核Hoechst着色为淡蓝色,形态呈圆形,内有较深的蓝色颗粒;中早期凋亡细胞核Hoechst着色呈亮蓝色,或核呈分叶,碎片状,边集;坏死或晚期凋亡的细胞核PI着红色,Hoechst因细胞膜破裂而不能着色.取体外培养的C2C12细胞,制备单细胞悬液过程同上,按1.8X107 L-1密度接种至6孔板,5 mL/孔.实验分组及干预措施同上,3个平行孔/组.处理36 h后立即进行Hoechst33342/PI凋亡双染,荧光倒置显微镜下观察,各组随机取6个不同视野进行细胞计数,计数实验重复3次,取平均值作为细胞凋亡率.结果:①过氧化氢对C2C12细胞增殖的影响:细胞处理36 h后与空白对照组比较,过氧化氢25μmol/L浓度组平均吸光度值与之相近(0.207±0.014,0.199±0.023;t=0.677,P＞0.05),即促进C2C12细胞增殖;过氧化氢50,100,300μmol/L浓度组平均吸光度值均显著下降(0.182±0.027,0.149±0.009,0.052±0.012;t=1.990,8.251,20.004,P均＜0.05),即抑制C2C12细胞增殖,且呈时效和量效关系.②过氧化氢对C2C12细胞凋亡的影响:细胞处理36 h后,与空白对照组比较,过氧化氢25 μmol/L浓度组细胞凋亡率明显降低[(9.09±0.85)%,(4.61±0.67)%;t=22.95,P＜0.01];过氧化氢50,100,300 μmol/L浓度组细胞凋亡率则明显提高[(33.50±5.74)%,(45.95±6.82)%,(76.47±4.66)%;t=4.35,4.68,18.02,P均＜0.01],且呈时效和量效关系.结论:活性氧在C2C12成肌细胞增殖与凋亡过程中扮演重要角色,低浓度可促进C2C12细胞增殖,高浓度则能够抑制其增殖并促进凋亡,且呈时效和量效关系.提示氧化应激对成肌细胞的生长具有调节作用.
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负载转基因成肌细胞和骨形态发生蛋白组织工程化骨修复骨缺损
背景:近年来有报道提出了睫状神经营养因子能够抑制成肌细胞体外成肌分化,可保持成肌细胞去分化状态的理论.两者可通过基因工程技术结合为组织工程化骨的构建提供种子细胞,联合骨形态发生蛋白在一定条件下促进骨缺损的修复.目的:探讨转染睫状神经营养因子基因成肌细胞与骨形态发生蛋白通过透明质酸钠凝胶载体结合修复兔桡骨节段性缺损的效果.方法:新西兰大白兔制备左侧桡骨中段造成1.0 cm的节段性骨缺损,缺损处以1.4 cm硅胶管桥接固定,管内植入负载骨形态发生蛋白与转睫状神经营养因子基因成肌细胞的透明质酸凝胶(实验组)、仅复合骨形态发生蛋白的透明质酸凝胶(对照组)或仅植入透明质酸凝胶(空白组).结果与结论:动物体内实验表明实验组的X射线阻射密度、大体标本以及病理组织学观察情况均优于对照组和空白组,对照组也优于空白组.说明应用透明质酸钠凝胶复合转基因成肌细胞和骨形态发生蛋白因子作为膜内填充物构建组织工程化骨具有可行性,其应用于修复兔桡骨节段性缺损效果理想.
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三七总皂苷对L6大鼠成肌细胞抗化学损伤模型的保护作用
背景:三七总皂苷具有活血祛瘀,通脉活络等多重药理作用,但其具体机制尚不明确.目的:观察三七总皂苷对L6大鼠成肌细胞H2O2方法:建立L损伤的保护作用及其对Bax和Bcl-2 蛋白表达的影响.6大鼠成肌细胞H2O2损伤模型,应用MTT法、DAPI化学荧光法和流式细胞仪分析检测各种剂量三七总皂苷(0.5,0.1,0.02 g/L)对L6大鼠成肌细胞存活率的影响;通过免疫荧光抗体细胞化学法研究各种剂量三七总皂苷(0.5,0.1,0.02 g/L)对L6结果与结论:L大鼠成肌细胞Bax和Bcl-2 蛋白表达的影响.6大鼠成肌细胞经H2O2损伤后细胞存活率降低、凋亡率增加,三七总皂苷能明显提高经H2O2损伤后细胞的存活率,降低凋亡率;免疫荧光抗体细胞化学法表明三七总皂苷能促进Bcl-2 表达,抑制Bax表达.结果可见三七总皂苷对L6大鼠成肌细胞H2O2
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重组成肌细胞合成人降钙素促进大鼠成骨细菌细胞增殖和分化
背景:大剂量多次喷鼻或者肌注降钙素能有效地预防绝经后妇女脊柱骨的丟失.但是降钙素需要长时期反复用药、价格昂贵、且有弱的抗原性,限制了长期使用.基因治疗可以为骨质疏松症提供更加有效、经济的治疗方案,同时减少药物的副作用.目的:观察人降钙素基因在成肌细胞中的表达,分析重组人降钙素对体外大鼠成骨细胞的影响.设计:以基因为实验对象,对比观察实验.单位:复旦大学放射医学研究所.材料:实验于2005-12/2006-06在复旦大学放射医学研究所完成.选用健康SD胎鼠10只,由复旦大学放射医学研究所提供.人降钙素单克隆抗体购于美国santa Cruz生物技术公司.L6成肌细胞由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所提供.方法:在L6成肌细胞培养基中分别加入pcDNA3.0-hCT脂质体转染混合物(转染组)和空载体pcDNA3.0脂质体混合物(对照组)进行培养.采用ELISA法、Westem Blot和免疫组织化学鉴定目的基因的蛋白表达.在成骨细胞培养基中分别加入1×10-14,1×10-13,1×10-12mol/L重组人降钙素和MEM.主要观察指标:利用MTT和检测碱性磷酸酶活性的方法观察大鼠成骨细胞增殖和分化的变化.结果:EUSA法可在细胞培养液中检测到降钙素蛋白;Western blot及免疫组化均证实人降钙素在转染后的成肌细胞中获得稳定表达.当重组人降钙素的浓度为1×10-14,1×10-13 mol/L时成骨细胞活性和成骨细胞碱性磷酸酶活性较对照组增高,但差异无显著性意义(P＞0.05);浓度升高为1×10-12 mol/L时,明显高于对照组(P＜0.05).结论:借助基因转染的方法,成肌细胞可以稳定合成、分泌人降钙素.重组人降钙素有促进骨形成的作用.
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与甲壳素缝线体外复合培养大鼠成肌细胞株L6细胞的形态学
目的:探讨甲壳素作为骨骼肌组织工程支架材料的可行性.方法:实验于2002-06/12在南方医科大学应用解剖学研究所完成.大鼠成肌细胞株L6与甲壳素医用缝合线体外复合培养.倒置相差显微镜下观察细胞的形态和排列情况.并分别在体外复合培养的第1,2,3,4,5,6天,取出细胞支架复合体,扫描电镜观察成肌细胞的形态和排列情况.结果:①扫描电子显微镜观察显示,甲壳素医用可吸收缝线的表面比较粗糙.②倒置相差显微镜下可见大鼠L6细胞与甲壳素制备的医用可吸收缝合线间黏附良好,细胞沿缝线排列呈现串珠样,并可以见到细胞聚集现象.③扫描电子显微镜观察,接种24 h后,细胞主要为圆球形,随后细胞迁移、伸展、并见突起;第3天,成肌细胞主要为梭形,并见融合趋势;4 d后,细胞沿材料纵轴排列并相互融合,并见肌小管样结构形成及细胞外基质分泌.结论:甲壳素具有作为支架以构建组织工程化骨骼肌的潜能,支架的平行排列有助于工程化骨骼肌纤维良好方向性的形成.
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改良载体提高大鼠成肌细胞移植效率
目的:观察含1g/L透明质酸钠的F12培养基能否提高成肌细胞移植效率和促进组织修复.方法:实验于2003-9/2004-10在四川大学华西医院修复重建实验室完成.①选取5月龄SD大鼠84只,建立胫前肌的深度冻伤的动物模型.②术后第10天,再次手术暴露冻伤肌组织.随机分为4组:取42只,左侧胫前肌注射以含1g/L透明质酸钠的F12培养基为载体的成肌细胞为左侧成肌细胞组;右侧胫前肌注射以F12培养基为载体的成肌细胞为右侧成肌细胞组;另42只,左侧注射含1g/L透明质酸钠的F12培养基溶液为培养液组;右侧不予注射为空白组.③各组分别于术后第2,5,9天,2,4,8,12周取材观察肌质量变化及组织学改变;于术后第2,5,9天进行磷酸肌酸激酶及同工酶测试.结果:84只大鼠均进入结果分析.①各组胫前肌肌质量变化:术后第2天和第5天,空白组肌质量轻(P＜0.05),其余组间差异无显著性(P＞0.05).术后第9天及第2,4,8,12周,左、右侧成肌细胞组肌质量明显高于培养液组和空白组(P＜0.05),而左、右侧成肌细胞组之间、培养液组和空白组之间差异无显著性(P＞0.05).②组织学观察:两组移植细胞均分化形成肌纤维,参与组织修复.透明质酸钠还促进早期小血管的再生.③磷酸肌酸激酶及磷酸肌酸激酶同工酶含量:运用两种载体的成肌细胞移植,冻伤组织中的磷酸肌酸激酶及同工酶活性明显增高(P＜0.05),显示移植细胞在冻伤局部增殖、分化参与受损组织的修复,以含透明质酸钠溶液为载体的移植组成肌细胞参与修复的总体活性较高.结论:成肌细胞移植对冻伤的肌肉组织有明显的修复作用,以透明质酸钠的溶液为载体可以提高成肌细胞移植效率.
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自体成肌细胞修复周围神经缺损
目的:观察自体成肌细胞在神经再生室中的作用,探讨其作为组织工程的种子细胞修复周围神经缺损的可行性.方法:实验于2002-08/2003-08在北京军事医学科学院基础医学研究所九室完成.①成年Wistar大鼠30只,采用随机数字法分成成肌细胞组、细胞外基质凝胶组和生理盐水组,每组10只.②切除大鼠右坐骨神经6 mm,断端分别套入硅胶管,使神经两断端在硅胶管内相距13mm.③成肌细胞组:快速分离骨骼肌成肌细胞,差速贴壁法纯化、增殖,按1×109 L-1细胞浓度与细胞外基质凝胶混合,植入神经再生室内;细胞外基质凝胶组:神经再生室内植入细胞外基质凝胶;生理盐水组:神经再生室内植入生理盐水.④术后4,8,12周进行大鼠坐骨神经功能指数测定;术后12周进行大体观察、电生理检测、腓肠肌湿重、神经组织学及超微结构观察.结果:30只大鼠全部进入结果分析.①结蛋白免疫组织化学:阳性细胞平均达98.01%.②大体观察:术后12周,成肌细胞组和细胞外基质凝胶组均可见再生神经,外形似正常神经,直径较正常的神经干细,成肌细胞组略粗于细胞外基质凝胶组.生理盐水组导管内无再生神经通过间隙.③坐骨神经功能指数:术后8,12周,成肌细胞组显著高于细胞外基质凝胶组(8周:-71.788±3.569,-76.986±2.266;12周:-61.847±2.914,-69.527±1.765;P均＜0.01).④电生理检查:术后12周,成肌细胞组的运动神经传导速度及波幅明显高于细胞外基质凝胶组,成肌细胞组、细胞外基质凝胶组腓肠肌肌电图呈部分失神经电位表现,生理盐水组则为完全失神经电位.⑤腓肠肌湿重恢复率:成肌细胞组明显好于细胞外基质凝胶组和生理盐水组.⑥组织学检查:术后12周,成肌细胞组、细胞外基质凝胶组的再生神经纤维排列整齐、密集,神经导管交界处无瘢痕,成肌细胞组的再生神经纤维多且直径较粗大,排列更为规则.⑦透射电镜观察:成肌细胞组和细胞外基质凝胶组均见再生的有髓神经纤维.⑧再生神经纤维图像分析:术后12周,在有髓神经纤维密度、神经纤维有效面积、有髓神经纤维数量、直径及髓鞘厚度等指标上成肌细胞组均优于细胞外基质凝胶组.结论:自体成肌细胞能够促进周围神经再生,可以作为种子细胞应用于外周神经组织工程.
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同种异体脂肪干细胞移植促进大鼠骨骼肌功能的恢复
背景:超过骨骼肌自我再生能力的广泛损伤可导致不可逆的纤维化、瘢痕形成和功能丧失.以往研究证实,脂肪来源干细胞可用于各种肌组织的再生,其对骨骼肌急性损伤后功能恢复的影响鲜有报道.目的:观察同种异体脂肪干细胞移植对骨骼肌急性损伤大鼠骨骼肌再生与功能恢复的作用.方法:从10只SD大鼠皮下脂肪组织中分离脂肪间充质干细胞,进行流式细胞术鉴定和多向分化能力鉴定.将72只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、胶原蛋白组和脂肪间充质干细胞移植组,后3组建立腓肠肌急性钝挫伤模型,胶原蛋白组分5个注射点在腓肠肌肌腹注射共1 mL大鼠胶原蛋白Ⅰ,脂肪干细胞移植组分5个注射点在腓肠肌肌腹注射含1×106个脂肪干细胞的1 mL大鼠胶原蛋白Ⅰ.移植后7,14,28 d,苏木精-伊红染色观察腓肠肌结构并测量腓肠肌纤维横截面积;用张力传感器测量腓肠肌等长收缩肌力;称量腓肠肌湿质量并计算其与体质量比值;Western blot检测腓肠肌组织中Pax7、MyoG、MyoD的表达.结果与结论:①大鼠脂肪干细胞表达CD29和CD90,不表达CD31和CD34,具有成脂、成骨和成软骨分化能力;②在移植后28 d,脂肪干细胞移植组大鼠腓肠肌损伤部位可观察到新生的骨骼肌纤维,4组大鼠腓肠肌损伤部位均未观察到明显的纤维增生;③在移植后28 d,脂肪干细胞组腓肠肌湿质量及其与体质量比值均高于模型组和胶原蛋白组(P<0.01),脂肪干细胞移植组腓肠肌中肌纤维横截面积大于模型组和胶原蛋白组(P<0.01);④移植后7,14,28 d,模型组、胶原蛋白组、脂肪干细胞移植组腓肠肌等长收缩肌力均低于正常对照组(P<0.01),移植后28 d,脂肪干细胞移植组腓肠肌等长收缩肌力高于模型组和胶原蛋白组(P<0.01);⑤移植后14 d,脂肪干细胞移植组腓肠肌组织中Pax7和MyoD的表达高于模型组和胶原蛋白组(P<0.05),移植后28 d,脂肪干细胞移植组腓肠肌组织中MyoD和MyoG的表达高于模型组和胶原蛋白组(P<0.05);⑥结果表明,脂肪干细胞移植到急性受损骨骼肌中能促进肌纤维的再生和功能恢复.
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MAPK抑制剂对骨碎补总黄酮促进转基因成肌细胞成骨分化的影响
背景：前期研究中已证实低浓度骨碎补总黄酮含药血清对转睫状神经生长因子成肌细胞向成骨细胞分化具有促进作用，然而其潜在机制尚未明确。
目的：观察MAPK抑制剂对骨碎补总黄酮促进转基因成肌细胞成骨分化的影响。
方法：转睫状神经生长因子成肌细胞预处理接种后，在成骨诱导剂诱导下，检测空白血清、骨碎补总黄酮含药血清及加入p38 MAPK抑制剂SB203580各组碱性磷酸酶比活性变化，RT-PCR检测成骨相关基因核结合因子a1和碱性磷酸酶mRNA表达的差异，并采用Western-blotting技术定量分析加入p38 MAPK抑制剂后成骨相关蛋白核结合因子a1和碱性磷酸酶蛋白表达情况的变化，进行统计学分析。
结果与结论：①RT-PCR检测结果均显示骨碎补总黄酮血清组的成骨相关因子核结合因子a1 mRNA、碱性磷酸酶mRNA表达高，加入p38抑制剂SB203580后核结合因子a1 mRNA、碱性磷酸酶 mRNA表达明显下调；②Western-blot检测加入p38抑制剂SB203580后核结合因子a1 mRNA、碱性磷酸酶mRNA蛋白水平明显下降；③结果说明，p38 MAPK抑制剂可以下调骨碎补总黄酮促进转基因成肌细胞成骨相关基因表达及蛋白水平，骨碎补总黄酮可能通过激活p38 MAPK信号通路促进睫状神经生长因子成肌细胞向成骨细胞分化。 -
胰岛素样生长因子1基因转染成肌细胞促小鼠胫骨骨折愈合的作用
背景:随着基因治疗的研究发展,将转有胰岛素样生长因子1基因的细胞移植入损伤区,达到该基因在体内的持续表达已可行,并有可能解决骨折患者骨不连及骨延迟愈合等难题.目的:观察携带人胰岛素样生长因子1基因的成肌细胞体内局部多点注射对C57BL/6J小鼠胫骨骨折愈合的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-01/2008-04在汕头大学医学院完成.材料:8周龄雄性C57BL/6J小鼠42只,体质量22～25 g,建立左胫骨骨折的动物模型.方法:42只小鼠随机数字表法分为2组,每组21只.实验组于骨折处周围肌肉中多点注射0.3 mL转人胰岛素样生长因子1基因成肌细胞悬液;对照组注射0.3 mL生理盐水.分别在造模后2,3,4周每组各随机取7只小鼠处死,取材,行苏木精-伊红染色.主要观察指标:各组动物骨折部位形成骨痂面积的大小和组成成分的变化;外源性细胞在体内存活及表达人胰岛素样生长因子1情况;各组动物骨密度及骨痂细胞生长情况.结果:①实验组转基因成肌细胞BrdU及人胰岛素样生长因子1免疫组织化学染色均阳性,4周实验组平均灰度值虽稍高于2周实验组,但差异无显著性意义(P＞0.05).②携人胰岛素样生长因子1基因的成肌细胞移植入C57BL/6J小鼠胫骨骨折处周围肌肉中可存活4周以上,并能稳定地分泌人胰岛素样生长因子1.③实验组造模后各时间点外骨痂中小梁骨占骨痂总面积的百分比均高于对照组,其中第3,4周经F检验差异有显著性意义(P＜0.05);4周实验组骨痂骨密度高于对照组(P＜0.05).④电镜观察可见实验组骨生成细胞的数量、活跃程度和胶原纤维的数量、分布均优于对照组.结论:局部注射转人胰岛素样生长因子1基因的成肌细胞可以促进C57BL/6J小鼠胫骨骨折的愈合.
关键词： 人胰岛素样生长因子1 成肌细胞 骨折 小鼠 -
骨骼肌中筋膜源性细胞分化为软骨细胞的能力
背景:骨骼肌中的肌源性细胞在骨形态发生蛋白4与转化生长因子β3的作用下具有成软骨分化的能力,但由于骨骼肌组成复杂,其中包括肌纤维组织、筋膜组织、血管组织、神经组织等,所以其中具备向软骨分化能力的细胞组织来源尚未确定.目的:观察骨骼肌中筋膜源性细胞分化成软骨细胞的能力,以明确骨骼肌来源的细胞中具有成软骨分化能力的种子细胞.方法:分离大鼠的臀大肌筋膜组织,剪成细小组织块后于含骨形态发生蛋白4和转化生长因子β3的软骨形成培养基中培养,在第14天收集样本,使用阿尔新蓝、苏木精-伊红染色和番红O染色来鉴定筋膜源性细胞的成软骨细胞分化能力;使用结蛋白、CD34、波形蛋白、v-WF和α平滑肌肌动蛋白相应抗体的免疫染色来研究筋膜源性细胞上各种不同细胞标志物在的表达情况;筋膜源性细胞与L6大鼠成肌细胞不同比例混合(1:0,4:1,1:1,1:4,0:1),用免疫染色方法分析筋膜源性细胞和L6细胞分化成软骨细胞的能力.结果与结论:①当在软骨形成培养基中培养第14天时,在阿尔新蓝和番红O免疫染色为阳性结果,表明筋膜组织块中的细胞具有分化成软骨细胞的能力;②分离的筋膜源性细胞的结蛋白,CD34、v-WF 抗原和 α平滑肌肌动蛋白的表达是阴性的,但超过90%的细胞表达波形蛋白;③纯筋膜源性细胞成软骨分化能力强,随着L6大鼠成肌细胞比例增高,其成软骨分化能力逐渐下降;④结果提示,从骨骼肌中筋膜源性细胞表面标记物分析、免疫染色及筋膜源性细胞与L6大鼠成肌细胞混合培养对比后,表明筋膜源性细胞具有分化成软骨细胞的能力,是骨骼肌来源的细胞中具有成软骨能力的种子细胞.
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周期性张应力下成肌细胞中半胱天冬氨酸蛋白酶9参与力学信号传导
背景：功能矫形使面颌部肌肉发生适应性改建，以纠正错颌畸形。成肌细胞是适应性改建的主要体现者，周期性牵张应力导致成肌细胞凋亡，而半胱天冬氨酸蛋白酶9是线粒体凋亡通路中的重要因子。
目的：明确半胱天冬氨酸蛋白酶9在不同时间周期性张应力作用下的表达变化。
方法：以大鼠L6成肌细胞为实验对象，在成功构建成肌细胞体外培养-力学刺激模型的基础上，通过多通道细胞牵张应力加载系统，分别对待测细胞持续施加1，6，12，24 h的周期性张应力，不加力组为对照组。倒置相差显微镜下观察成肌细胞的形态学改变和生长状况；运用RT-PCR和Western Blot技术检测周期性张应力作用下半胱天冬氨酸蛋白酶9的mRNA和蛋白含量变化。
结果与结论：倒置相差显微镜观察结果显示成肌细胞施加周期性张应力后贴壁生长情况良好，细胞无变性并且脱落率极低，说明成功构建了成肌细胞体外培养-力学刺激模型。RT-PCR和Western Blot检测结果显示，随着加力时间的延长，半胱天冬氨酸蛋白酶9 mRNA含量和活化型半胱天冬氨酸蛋白酶9的蛋白含量均显著增加，而半胱天冬氨酸蛋白酶9前体蛋白含量随着加力时间的延长均显著降低。可见半胱天冬氨酸蛋白酶9参与了周期性张应力作用下的力学信号传导。
