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幼猫眼外肌成肌细胞原代培养和鉴定
背景：制作斜视模型需要双眼前移、具有一定双眼视功能的高级哺乳类动物(如猫科)，体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的幼猫眼外肌成肌细胞，对组织工程及探讨药物治疗斜视可行性显得至关重要。
目的：探索幼猫眼外肌成肌细胞原代培养方法。
方法：利用两步酶消化法联合差速贴壁法获取幼猫眼外肌成肌细胞，进行体外培养，对获得的细胞进行形态学研究，以免疫组织化学方法进行鉴定。
结果与结论：在生长培养基条件下，成肌细胞增殖旺盛；在分化培养基条件下，成肌细胞分化良好，可融合成肌管，且表达结蛋白。提示利用两步酶消化法联合差速贴壁法成功培养幼猫眼外肌成肌细胞，该方法实用性强，所得成肌细胞纯度高，为进一步观察成肌细胞生长特性，并深入探讨药物治疗斜视可行性奠定了基础。 -
低氧对成人成肌细胞增殖的影响
背景:人成肌细胞可再生不同组织的细胞来用于组织工程方面的研究,其体外培养时增殖能力有限,因此,进行促进人成肌细胞体外增殖的研究很重要. 目的:通过间歇性低氧处理,观察成年大鼠原代培养的成肌细胞的增殖能力的变化.设计:对比观察,重复测晕设计.时间及地点:实验于2007-08/2008-06在辽宁医学院附属第一医院外科实验室完成.对象:3例男性成人正常颞肌标本取自于开颅手术患者,年龄分别为23岁,29岁和36岁.患者均知情并同意.方法:取成人正常颢肌组织,分离培养成肌细胞并鉴定,将培养至第3代的成肌细胞分为常氧对照组、体积分数为0.1 O2组、0.03 O2组及无氧组.各组细胞采用4孔板培养4 d后进行记数.主要观察指标:不同培养条件下细胞的生长状态和特点;以自动生化分析仪测定培养液中氧含量,以乳酸分析仪测定细胞培养液中的乳酸浓度;以流式细胞仪测定各组细胞的增殖指数.结果:随着环境氧浓度的下降,细胞培养液中的氧含量也逐渐下降(P<0.05),而乳酸浓度逐渐升高(P<0.05),当环境氧浓度为0时,乳酸浓度大于2.0 mmol/L.低氧组成肌细胞数日比常氧组明显增加,尤以体积分数为0.1的02组更为明显,其成肌细胞数目约为常氧组的2.5倍(P<0.05),体积分数为0.03的O2组在低氧1 d和2d时增殖指数低于常氧组,低氧4d时,增殖指数增加;而体积分数为0.1的O2组增殖指数一直高于常氧组(P<0.05).结论:轻中度低氧有利于成人成肌细胞的体外增殖,提示低氧作为体外的一种可控制因素,可调节成肌细胞的增殖,对于其基础及临床研究具有一定的意义.
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成肌细胞及其在骨骼肌研究中的应用
目的:总结成肌细胞在骨骼肌收缩功能和细胞基因治疗研究中的应用.资料来源:应用计算机检索Medline及Science Direct(Elsevier),EBSCOhost,Kluwer Online等数据库2000-01/2006-10相关骨骼肌成肌细胞及其应用研究方面的文献,检索词"myoblast,contract,mitochondria,genetreatment",限定文献语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库2002-01/2006-10相关骨骼肌成肌细胞及其应用研究方面的文献,检索词"成肌细胞,骨骼肌收缩,基因治疗",限定文献语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,选取包括成肌细胞特性、收缩研究及应用等方面的文献,开始查找全文.纳入标准:有关成肌细胞的生物学特性、在骨骼肌收缩中的应用、在基因治疗中应用方面的文献.排除标准:重复研究、个案报告、综述、Meta分析的文献.资料提炼:共检索到125篇关于成肌细胞研究的文献,终纳入35篇符合标准的文献.资料综合:成肌细胞是肌组织的前体细胞,易培养、可塑性强,具有骨骼肌的许多重要生物特性,且细胞能够融合进在体骨骼肌组织中,因此在骨骼肌收缩运动引起的细胞离子浓度、线粒体功能和肌型变化等的研究以及细胞移植治疗骨骼肌肌病和修复心肌组织的研究上都有着广泛的应用.本文综述近年来成肌细胞的生物学特性和骨骼肌收缩功能及基因治疗应用等方面所取得的相关进展.结论:成肌细胞可以为骨骼肌在收缩功能上的研究提供一个很好的研究平台,其在基因治疗研究中的应用也为肌组织工程的研究奠定了基础.
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逆转录病毒载体介导人胰岛素样生长因子Ⅰ在大鼠成肌细胞中的表达及分泌
目的:将经逆转录病毒载体的介导的人胰岛素样生长因子Ⅰ基因导人大鼠成肌细胞,观察其是否表达,为组织工程人工肌肉体内基因治疗打下基础.方法:实验于2005-10/2006-12在华中科技大学同济医学院协和医院心血管病研究所完成.①实验材料:PLghlGF1SN由本实验室保存,逆转录病毒包装细胞系GP+E86购自Clontech公司,包装细胞PT67购自ATCC.②实验方法:选用新生SD乳鼠骨骼肌进行成肌细胞的原代培养,选用新生SD乳鼠心脏进行心肌细胞的培养.通过脂质体2000将人胰岛素样生长因子Ⅰ c DNA导入逆转录病毒包装细胞PT67,经过G418筛选获取稳定表达病毒的克隆,NIH3T3细胞测定病毒滴度,挑取滴度高的克隆扩增,收取高滴度的病毒上清液,转染成肌细胞.③实验评估:G418筛选转染过的成肌细胞,采用ELISA方法检测其上清液中人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,采用MTT法检测人胰岛素样生长因子Ⅰ的生物学活性.结果:①病毒滴度的测定:利用不同量的病毒上清感染1×105 NlH3T3细胞,并经G418筛选,测得不同PT67克隆的培养上清中,病毒滴度高为8×105 cfu/mL.②ELISA方法检测人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达:在转染后大鼠成肌细胞分泌的上清液中可以检测到人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,经过G418筛选2周后,收集培养液,人胰岛素样生长因子Ⅰ浓度高在40 μg/L,总量可以达到(150～200)ng/2×106/d.未转染成肌细胞组人胰岛素样生长因子Ⅰ浓度约在0.3 μg/L.③MTT法检测人胰岛素样生长因子Ⅰ的生物学活性:转染的成肌细胞培养上清液刺激心肌细胞后,心肌细胞活力明显增加.结论:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因可在鼠成肌细胞内稳定表达并具有生物学效应,可用于心血管系统基因治疗的研究.
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成肌细胞体外培养-力学刺激模型与周期性张应力的影响
背景：内质网应激参与多种疾病的发生发展过程，如动脉粥样硬化、糖尿病、阿尔茨海默病，GRP78是内质网应激的标志蛋白，GRP78的表达水平反映内质网应激的程度。
目的：研究周期性张应力对 L6大鼠成肌细胞 GRP78表达的影响，以明确周期性张应力与内质网应激的关系。
方法：在成功构建L6大鼠成肌细胞体外培养力学刺激模型的基础上，采用RT-PCR和Western blot法分析周期性张应力对GRP78 mRNA和蛋白表达的影响。加力组分别给予1，6，12，24 h的力学刺激，加载频率为10 cycles/min，拉伸变形幅度为15%。对照组与实验组在同时种板，不给予力刺激。
结果与结论：GRP78 mRNA随着加力时间的延长呈一致上升趋势，与对照组相比，差异均有显著性意义(P<0.05)；GRP78蛋白在加力1 h后，蛋白表达量开始升高，加力6 h后蛋白表达量显著升高，到24 h达到峰值，与对照组相比，差异均有显著性意义(P<0.05)。由以上结果得出，在一定时间范围内，周期性张应力可引起内质网应激，并且随着时间的延长逐渐增强；持续的应力刺激，可引起严重的内质网应激导致成肌细胞凋亡。 -
逆转录病毒介导的对原代培养成年大鼠成肌细胞基因转染的研究
目的探索成年大鼠成肌细胞的原代培养方法以及逆转录病毒对其的基因转染.方法取成年SD大鼠的胸大肌,利用组织块法进行培养,并对培养细胞进行形态学研究和免疫细胞化学鉴定.以逆转录病毒为载体,将绿色荧光蛋白基因导入成年大鼠成肌细胞,利用倒置荧光显微镜及流式细胞仪对转染细胞进行观察.结果采用组织块培养法,2周后成肌细胞的密度可达107/ml, 免疫细胞化学分析显示90%以上的细胞呈骨骼肌特异的myogenin抗体染色阳性.荧光显微镜和流式细胞仪检测发现eGFP基因可在成年大鼠成肌细胞中有效地表达,其转染效率约为12.82%.结论利用组织块法成功培养成年大鼠原代成肌细胞,该方法实用性强,所得成肌细胞纯度高;逆转录病毒可介导成肌细胞的基因转导,为深入研究心肌梗死瘢痕中转基因成肌细胞自体移植奠定了基础.
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透明质酸钠对大鼠成肌细胞体外成骨分化的影响
目的 研究透明质酸钠对成肌细胞体外成骨诱导分化的影响.方法 运用差速贴壁法和(或)酶消化法分离纯化的大鼠成肌细胞,将培养至第3代的细胞分为:(1)实验组:采用含0.1%的透明质酸钠和500ng/mL的重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)的培养基进行培养;(2)对照组:以含500ng/mL rhBMP-2的培养基进行培养.观察诱导过程中成肌细胞形态变化.第3周时对其进行成骨指标检测(碱性磷酸酶活性,Ⅰ型胶原免疫组化,茜素红和碱性磷酸酶的钙结节染色).结果 实验组和对照组成肌细胞在诱导过程中形态学改变相似.实验组和对照组碱性磷酸酶活性均升高,2组间差异无统计学意义,Ⅰ型胶原免疫组化均呈阳性,茜素红和碱性磷酸酶染色均可见大量钙结节.结论 透明质酸钠不抑制成肌细胞体外成骨分化,与成肌细胞具有良好的生物相容性.
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Ghrelin对高脂环境下大鼠成肌细胞糖脂代谢的影响
探讨Ghrelin对高脂环境下大鼠成肌细胞糖脂代谢的影响,为深入研究2型糖尿病的防治提供理论依据.方法对照组用含0.5%BSA的DMEM培养12 h；高脂组用0.3 mmol/L棕榈酸(PA,含0.5%BSA)培养12 h；干预组分为3组,分别在高脂干预同时加入10-11 mol/L、10-9 mol/L、10-7 mol/L Ghrelin作用12 h.用油红O染色法检测成肌细胞脂肪变性后甘油三酯沉积;用GPO-POD酶法测定成肌细胞脂肪变性后甘油三酯含量；用同位素示踪法检测葡萄糖摄取.结果 与对照组比较,在0.3mmol/L PA组中,甘油三酯沉积和含量明显增加,葡萄糖摄取明显下降.与0.3 mmol/L PA组对比,随着给予Ghrelin的浓度逐渐增加,甘油三酯沉积和含量逐渐下降,葡萄糖摄取逐渐增加,并呈剂量依赖关系,其中10-7 mol/L Ghrelin对损伤的修复作用为明显.结论 Ghrelin可减少大鼠成肌细胞的甘油三酯沉积,增加高脂环境下大鼠成肌细胞的糖摄取,并且存在剂量依赖关系.
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应力作用下成肌细胞分化的信号转导研究
1成肌细胞分化
肌肉发生主要是指在胚胎发育的过程中，其中涉及诸多的生物学过程。在时间上，这一过程可以大致分为以下三个阶段：定向分化、细胞增殖和终极分化［1］。
2成肌细胞分化过程中细胞周期的调节
成肌细胞分化形成肌管的过程中，成肌细胞从细胞周期中退出，相互融合形成多核的肌管细胞。因此，细胞周期在肌肉发生中起着相当重要的作用。CDK 抑制因子 p21和眼癌蛋白（pRb）对肌肉发生中的有丝分裂后状态的建立起重要作用［2］。溴脱氧尿苷标记实验显示上调 p21伴随着退出细胞周期的开始和骨骼肌分化信号通路的早期事件。缺少 pRb ，一个CDK 抑制剂的下游靶蛋白，肌细胞不能产生不可逆的细胞周期的退出和分化。骨骼肌特异性基因的转录可被cyclins和CDKs或 E2F1的强制性表达所抑制，此抑制作用可被激活突变型的pRb的表达所逆转［3］。 -
间充质干细胞免疫调节作用研究进展
骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)是骨髓中的多能祖细胞,具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、成肌细胞等多种结缔组织分化的性质,并可支持造血[1-4].体外试验和异基因移植研究中均显示,MSCs具有较强的免疫调节功能,近年来对MSCs的免疫调节及其临床应用的研究取得了较大进展.
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微电流脉冲体外诱导神经干细胞增殖分化的研究
目的 探讨微电流脉冲对神经干细胞体外增殖分化的诱导作用.方法 采用联合培养和微电流脉冲技术改变神经干细胞生长的微环境,通过免疫细胞化学技术及电子显微镜技术观察神经干细胞增殖分化情况.结果 骨骼肌成肌细胞及微电流脉冲均可诱导神经干细胞分化(细胞ChAT阳性率分别为5.90%和6.48%),与神经干细胞自然分化组相比差异显著(细胞ChAT阳性率为4.03%).结论 微电流脉冲对神经干细胞的体外增殖分化具有一定的诱导作用.
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巴戟天糖链对骨骼肌成肌细胞向心肌样细胞分化的影响
目的：探讨巴戟天糖链诱导骨骼肌成肌细胞向心肌样细胞分化的作用。方法巴戟天糖链分为大、中、小三个剂量组（500、300和100μg／ml），采用离体纯化培养乳鼠双侧后肢骨骼肌成肌细胞，观察给药前后成肌细胞对异丙肾上腺素（ IP）的正性变时作用；RT－PCR法检测成肌细胞中GATA－4 mRNA的表达。结果巴戟天糖链小剂量组成肌细胞正性变时作用不明显（P＞0．05），巴戟天糖链中剂量组和大剂量组成肌细胞正性变时作用显著（ P＜0．05）。与阳性药5－氮杂胞苷相比，巴戟天糖链诱导后，各剂量组均可显著上调心脏转录因子 GATA－4 mRNA 的表达（ P＜0．05）。结论巴戟天糖链具有诱导成肌细胞向心肌样细胞分化的潜在可能，诱导后可出现心脏转录因子GATA－4基因的表达。
关键词： 巴戟天糖链 成肌细胞 心脏转录因子GATA-4 -
二氮嗪预处理对氧化应激损伤L6骨骼肌成肌细胞的作用
目的 利用二氮嗪(DZ)预处理骨骼肌成肌细胞,探讨DZ预处理对H202损伤L6骨骼肌成肌细胞的作用.方法 培养L6骨骼肌成肌细胞株(L6SkM),分成正常对照组、H2O2损伤组和DZ预处理组,用HE染色、MTT、LDH检测、免疫组化、流式等方法检测DZ预处理对氧化应激损伤L6骨骼肌成肌细胞的作用.结果 DZ预处理能改善氧化应激损伤L6骨骼肌成肌细胞的形态结构,减少细胞凋亡,明显提高细胞的生存率.结论 DZ预处理对氧化应激损伤L6骨骼肌成肌细胞具有明显的保护作用.
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二甲双胍对脂肪变性成肌细胞内甘油三酯含量的影响
目的 探讨二甲双胍对棕榈酸诱导的脂肪变性成肌细胞内甘油三酯(Triglyceride,TG)含量的影响.方法 取Wistar大鼠乳鼠骨骼肌进行原代细胞培养,取第5代成肌细胞,分为5组:对照组(加入正常培养基)、模型组(PA组,加入0.25 mmol/L棕榈酸诱导24h)、干预组(Met 1、2、3组,加入0.25 mmol/L棕榈酸诱导24h后,分别加入2.5、5.0和7.5 μg/ml的二甲双胍,继续培养24h).油红O染色观察细胞内脂滴的变化,计算脂肪变性率；并检测细胞内TG的含量.结果 成功建立了成肌细胞脂肪变性模型.模型组较对照组脂变细胞数量明显增多,细胞内TG含量显著增加(P＜0.01),而经不同浓度二甲双胍作用后,各干预组脂变细胞数量减少,细胞内TG含量显著下降(P＜0.01),与二甲双胍浓度呈正相关.结论 二甲双胍可显著减少TG在成肌细胞内的沉积,促进成肌细胞的脂代谢,抑制脂肪变性的形成,具有明显的降脂作用.
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周期性张应力刺激下成肌细胞钙网蛋白的表达及变化
目的:检测成肌细胞钙网蛋白(CRT)在循环拉伸应力刺激下的表达变化.方法:体外构建面颌部成肌细胞力学刺激模型.加力组以0.5赫兹的加载频率和10％细胞拉伸变形幅度对细胞进行加力培养lh,6h,12h,24 h,运用实时荧光定量PCR技术跟Western Blot技术分别检测在周期性张应力作用下成肌细胞CRT在基因水平及蛋白水平的表达变化.结果:当对细胞加力6h后,CRT mRNA及蛋白表达量开始增多,加力12h后CRT mRNA及蛋白表达量到达多(P＜0.01),加力0h组与加力12h组之间差异有显著的统计学意义(P＜0.01).结论:持续的周期性张应力刺激下CRT mRNA及蛋白表达增加.
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自噬在应力诱导成肌细胞凋亡中的作用初探
目的:探讨自噬在周期性张应力介导的成肌细胞凋亡中的作用,以明确应力诱导内质网应激引起自噬与凋亡之间的关系.方法:在成功构建L6大鼠体外培养——力学刺激模型的基础上,采用Western Blot法分析周期性张应力对自噬相关蛋白LC3蛋白表达的影响,并通过Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡情况.加力组分别给予1,6,12,24 h的力学刺激(拉伸变形率为15％,频率为10循环/min),3-MA组和Rapamycin组在加力2h前分别加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤和自噬激活剂雷帕霉素并且加力24h,0h组与实验组在同时种板但是不给予力刺激.采用SPSS17.0统计软件对以上数据进行统计分析.结果:成肌细胞中的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值随加力时间延长呈上升趋势,24 h达高(P＜0.05);抑制组的细胞凋亡率(18.75± 1.06％)相对于0 h组(0.726±0.13％)和加力24 h组(14.84± 1.14％)的明显升高(P＜0.05);Rapamycin组相对于加力24 h组的细胞凋亡率明显下降(8.88± 1.08％vs 14.84± 1.14％),但是细胞凋亡率仍然高于0h组的(8.88± 1.08 ％vs 0.726± 0.13％).结论:在一定时间范围内,周期性张应力可诱导成肌细胞发生自噬,并且自噬活性与作用时间成正比;自噬可以降低应力介导的成肌细胞凋亡的活性.
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功能矫形前伸青春期大鼠下颌后翼外肌MyoD、myogenin的表达
目的:探讨"应力-生长(改建)"在细胞水平上的体现,为功能矫形治疗和矫治效果的保持提供新思路和实验依据.方法:本实验选用20只4周龄,雄性SD大鼠随机分为8组.其中实验组大鼠经戊巴比妥麻醉后佩戴上颌斜面导板,对照组未佩用.依据时间不同又分为四组:ld,7d,14d,21d.采用RT-PCR技术分析各组大鼠翼外肌组织中肌分化相关基因MyoD、myogeni mRNA的表达变化.结果:未施加功能矫形力的大鼠翼外肌组织MyoD表达伴随其生长发育呈现递减趋势,实验组在第7d出现表达上调.同时,力学刺激后实验组动物myogenin的表达与对照组相比较在14d组出现明显上调.结论:功能矫形力作用于翼外肌组织可以诱导MyoD和myogenin的表达上调进而诱导成肌细胞的分化.
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自体成肌细胞和骨髓间充质干细胞移植对缺血坏死心肌的修复作用
目的 观察自体骨骼肌成肌细胞(SMs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)经冠脉移植至缺血坏死心肌后的分化情况及对缺血坏死心肌的修复作用.方法 取日本大耳白兔45只,随机分为SMs、BMSCs移植组和对照组,每组15只.移植组分别取臀肌和骨髓体外培养SMs和BMSCs.各组均结扎左前降支建立缺血坏死心肌模型.分别于再灌注后1 h经左前降支注射5-溴脱氧尿核苷(BrdU)标记的SMs、BMSCs悬液1 ml(5×1012个/L)或等量DMEM培养液.移植后24 h和4周用超声心动仪检查心脏功能变化.移植后4周以病理组织学检查HE染色及BrdU抗体、结蛋白(Desmin)抗体和骨骼肌特异性慢肌球蛋白重链(Slow-MHC)单克隆抗体,免疫组化染色评价移植细胞的分化情况.结果 移植后4周,SMs和BMSCs组在左室射血分数[(61.9±3.6)%、(62.4±2.6)%]和左室短轴收缩率[(31.6±2.3)%、(30.8±1.9)%]较对照组[(53.2 ±2.3)%、(23.8±0.9)%]均有明显改善(P＜0.05);SMs与BMSCs组比较差异无统计学意义(P＞0.05);HE染色显示移植组心肌纤维排列有序,其中SMs组可见新生的多核肌样细胞.移植SMs和BMSCs BrdU抗体免疫组化染色阳性.SMs组SMsDesmin抗体和Slow-MHC单克隆抗体免疫组化染色阳性.结论 经冠脉自体移植的SMs和BMSCs可在缺血坏死心肌内存活.对心肌损伤具有修复作用,并同等程度地提高了心脏功能.
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成年大鼠骨骼肌成肌细胞的培养和鉴定
目的 探索成年大鼠骨骼肌成肌细胞的高浓度培养方法.方法 以成年同种系Wistar大鼠为研究对象,采用两步消化法获取大鼠骨骼肌卫星细胞,进行体外培养,对获得的细胞进行形态学研究,以免疫组织化学方法进行鉴定.结果 细胞增殖旺盛,分化良好,可融合成肌管.免疫细胞化学染色显示,骨骼肌卫星细胞呈弱阳性,肌管呈强阳性.结论 两步消化法体外培养的骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力,用此种方法可培养出高纯度的骨骼肌成肌细胞,操作简单、污染少.
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微囊化对转VEGF基因成肌细胞血管内皮生长因子分泌的实验研究
目的 观察微囊化过程对转VEGF基因成肌细胞分泌VEGF蛋白的影响,从而为微囊化细胞应用于促进缺血皮瓣动物模型皮瓣成活的实验研究做准备.方法 将成长旺盛的转VEGF基因成肌细胞分别进行微囊化及非微囊化.14 d内定期对培养液定量提取,检测VEGF蛋白浓度,进行统计学分析.结果 检测结果证实,微囊化及非微囊化后无明显差别,两者VEGF浓度均在1～4 d上升,在第5 d接近峰值,7 d后浓度缓慢下降.结论 微囊化与否对转VEGF基因成肌细胞分泌VEGF蛋白过程没有显著影响.
