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L6细胞胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型
背景:在胰岛素抵抗的细胞模型中,以游离脂肪酸诱导3T3-L1脂肪细胞和高胰岛素诱导的HepG2肝癌细胞为常见,对分布为广泛靶组织骨骼肌的胰岛素抵抗模型报道较少.目的:拟使用L6细胞株建立胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-06/2008-05在辽宁医学院生物化学与分子生物学教研室完成.材料:L6细胞株由中国协和医科大学细胞中心提供.α-MEM培养基为美国Gibco公司产品.方法:复苏后的L6细胞置于α-MEM培养基中诱导培养14 d,以考马斯亮蓝染色观察肌管出现来确定L6成肌细胞株分化完成.将分化后的细胞建立胰岛素抵抗模型,按1 × 108/孔接种于24孔板内,用含体积分数为0.02胎牛血清的α-MEM培养,以L6细胞贴满24孔板的板底为宜.换液后,向各孔内分别加入含体积分数为0.02牛血清白蛋白的α-MEM无血清培养基饥饿培养5 h.设立2组,实验组的板孔内加入含1×107mol/L胰岛素的HEPES缓冲液(136mmol/LNaCl,4.7mmol/LKCl,1.25 mmol/L MgSO4,1.2 mmol/L CaCl2,0.2%牛血清白蛋白,20 mmol/L HEPES,pH 7.4)孵育1 h;对照组的板孔内加入不含胰岛素的HEPES缓冲液孵育1 h.弃上清后用HBS缓冲液冲洗,每孔内分别加入含0.1 mol/L葡萄糖的HBS缓冲液100 μL,孵育10 min后取出置于冰板上快速回收上清.主要观察指标:考马斯亮蓝染色观察L6细胞出现肌管结构情况,葡萄糖氧化酶法检测上清中葡萄糖浓度.结果:诱导前L6细胞未见肌性结构出现,诱导分化后L6细胞内出现肌管结构.使用α-MEM无血清培养基饥饿培养1,3 h,两组上清中葡萄糖浓度基本相似(P>0.05);使用α-MEM无血清培养基饥饿培养5 h后,实验组上清中葡萄糖浓度明显高于对照组(P<0.05).结论:诱导分化成肌后的L6骨骼肌细胞经α-MEM无血清培养基饥饿培养5 h,在胰岛素浓度为1×10-7mol/L的刺激下可形成胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型.
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海南蒲桃提取物对L6细胞砷中毒缓解作用的体外实验
目的:研究海南蒲桃提取物对砷酸盐引起的L6骨骼肌细胞葡萄糖内稳态破坏及线粒体功能异常的缓解作用.方法:通过测量多个指标如丙酮酸激酶活性、葡糖激酶、线粒体膜电位等衡量细胞内葡萄糖水平及线粒体功能,并测量相关标志物的蛋白质及mRNA表达情况,如葡萄糖转运体4、胰岛素受体基质1、胰岛素受体基质2、葡糖激酶等以分析可能有关的信号通路.结果:海南蒲桃提取物能够通过葡萄糖转运体4通路改善砷中毒的L6细胞内诸多标志物的表达,使其正常化,与模型组相比差异有统计学意义.结论:海南蒲桃提取物对细胞砷中毒有明显的缓解作用,未来可考虑将其用于治疗砷中毒相关疾病如高血糖症等.
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牛蒡子苷对L6骨骼肌细胞中腺苷酸活化蛋白激酶信号通路的影响
目的：探讨牛蒡子苷在L6骨骼肌细胞中对葡萄糖消耗和腺苷酸活化蛋白激酶（ AMP?activated protein kinase， AMPK）信号通路的调节作用。方法用含2％胎牛血清的1640培养基诱导L6骨骼肌细胞分化，直至细胞生长出肌管，分化完成后的L6骨骼肌细胞用含有不同浓度牛蒡子苷的培养基培养24 h后，采用葡萄糖氧化酶法检测细胞葡萄糖消耗，western blot法检测AMPK的亚单位AMPKα和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（ p?AMP?activated protein kinase，p?AMPKα）的蛋白表达水平；以real?time PCR法检测过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1α（ peroxisome?proliferator?activated receptorγcoactiva?tor?1α，PGC?1α） mRNA表达水平。结果牛蒡子苷浓度为1000 g／L 时，可增加 L6骨骼肌细胞的葡萄糖消耗，差异显著（ P＜0．01）；与对照组相比，牛蒡子苷呈浓度依赖性的增强L6骨骼肌细胞中p?AMPKα蛋白表达水平；并以相同的趋势增强PGC?1α mRNA表达水平。结论牛蒡子苷增加L6骨骼肌细胞的葡萄糖消耗，并激活AMPK／PGC?1α信号通路，具有潜在的改善胰岛素抵抗的作用。
