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Myod1和Myog真核共表达载体构建及鉴定
背景：目前研究发现，生肌调节因子家族的各成员之间具有相互协同和相互促进的作用。因此，联合应用Myod1和Myog两个成员进行基因治疗，可能会取得更好的疗效，能够为防治失神经支配骨骼肌萎缩寻找新的思路。
目的：构建Myod1和Myog基因的真核共表达载体。
方法：通过RT-PCR的方法克隆大鼠Myod1和Myog基因的全长cDNA，酶切后依次插入到pVAX1载体中，以构建重组的Myod1和Myog真核共表达载体pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP，采用基因测序的方法进行鉴定。将pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP对体外培养的3T3细胞进行转染，利用Western blot检测3T3细胞中Myod1蛋白和Myog蛋白的表达，验证其能否正确表达目的蛋白。
结果与结论：基因测序结果表明，真核共表达载体 pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP 内的 Myod1和 Myog cDNA 的序列长度及碱基顺序均与所公布的序列相同。将该载体转染到体外培养的3T3细胞内， Western blot能够检测到3T3细胞中Myod1和Myog蛋白的条带。结果证实，实验成功构建了重组Myod1和Myog真核共表达载体pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP。 -
唾液腺腺样囊性癌细胞系中5个抑癌基因甲基化及其表达
目的:探讨唾液腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)细胞系中CDH13、RASSF2A、TFPI-2、hMLH-1、MyoD1基因的甲基化及其与mRNA表达之间的关系.方法:甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)法检测ACC细胞系ACC-2、ACC-3、ACC-M中CDH13、RASSF2A、TFPI-2、hMLH-1、MyoD1基因的甲基化;RT-PCR及荧光实时定量PCR对存在甲基化的基因进行mRNA水平的检测.结果:3个细胞系中均存在CDH13、RASSF2A、TFPI-2基因的甲基化和未甲基化,只存在MyoD1基因的甲基化和hMLH-1基因的未甲基化;ACC-2中CDH13基因mRNA水平的表达显著高于ACC-M,ACC-3中RASSF2A的表达显著高于ACC-2、ACC-M,3个细胞系中均未检测到MyoD1基因的表达.结论:ACC细胞系中,CDH13、RASSF2A、TFPI-2、MyoD1基因的甲基化为常见事件,甲基化可能为MyoD1基因失活的主要机制,CDH13基因的表达可能与ACC的转移相关.
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32例小儿横纹肌肉瘤生肌因子的表达
目的探讨小儿横纹肌肉瘤中生肌因子(MyoD1、Myogenin)的表达及意义.方法应用免疫组化Envision法检测32例小儿横纹肌MyoD1、Myogenin、Des、Sr-A、MG标记物的表达.结果5种标记物在小儿RMS表达的阳性率依次为:Myogenin 90.6%、MyoD1 81.1%、Des 65.5%、Sr-A 50.0%、MG 46.8%. 结论Myogenin与MyoD1较Des、Sr-A、MG在诊断小儿RMS中灵敏度及特异性方面具有显著的优越性,有很高的诊断价值.Myo-genin特异性略高于MyoD1,是目前诊断小儿RMS的佳免疫组化标记物.
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小细胞恶性肿瘤MyoD1、myogenin的染色敏感性和特异性
目的:研究肌源性调节蛋白在小细胞恶性肿瘤病理诊断与鉴别诊断中的作用.方法:应用免疫组化S-P法,对56例小细胞恶性肿瘤,包括19例的胚胎性横纹肌肉瘤、6例的腺泡状横纹肌肉瘤、3例的Wilm瘤、14例的Ewing肉瘤/PNETs、14例的神经母细胞瘤以及4例的多形性横纹肌肉瘤行MyoD1、myogenin、MSA、desmin、myoglobin和CD99染色标记.结果:MyoD1和myogenin阳性核染色分别见于21/29(72.41%)和20/29(68.97%)的横纹肌肉瘤.除多形性横纹肌肉瘤外,4例MyoD1与5例myogenin核染色阴性者没有重叠.3例Wilm瘤中2例幼年型MyoD1核染色阳性,而myogenin只有1例核染色阳性,另1例成年型Wilm瘤二者均染色阴性.14例的Ewing肉瘤/PNETs和14例的神经母细胞瘤未见核阳性染色.MyoD1和myogenin核阳性染色与横纹肌肉瘤的分化程度呈负相关,在较小的原始肿瘤细胞中MyoD1和myogenin核染色比例较高,而具有骨骼肌分化的、较大的横纹肌母细胞核阳性染色比例较低.在横纹肌肉瘤中,MyoD1阳性核染色的肿瘤细胞比myogenin多,myogenin多在小的肿瘤细胞核上染色,而MyoD1无论小的原始肿瘤细胞或是稍大的具有骨骼肌分化的肿瘤细胞均有不同程度的表达.MSA、desmin和myoglobin在小细胞肿瘤中染色的敏感性较低.结论:对于小细胞横纹肌肉瘤的诊断与鉴别诊断,MyoD1和myogenin是两种高度敏感性和高度特异性的抗体,当疑为胚胎性横纹肌肉瘤或腺泡状横纹肌肉瘤时,应使用一组抗体,包括MyoD1、myogenin、MSA、desmin、myoglobin等有助于确定诊断.
