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Myod1和Myog真核共表达载体构建及鉴定
背景：目前研究发现，生肌调节因子家族的各成员之间具有相互协同和相互促进的作用。因此，联合应用Myod1和Myog两个成员进行基因治疗，可能会取得更好的疗效，能够为防治失神经支配骨骼肌萎缩寻找新的思路。
目的：构建Myod1和Myog基因的真核共表达载体。
方法：通过RT-PCR的方法克隆大鼠Myod1和Myog基因的全长cDNA，酶切后依次插入到pVAX1载体中，以构建重组的Myod1和Myog真核共表达载体pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP，采用基因测序的方法进行鉴定。将pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP对体外培养的3T3细胞进行转染，利用Western blot检测3T3细胞中Myod1蛋白和Myog蛋白的表达，验证其能否正确表达目的蛋白。
结果与结论：基因测序结果表明，真核共表达载体 pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP 内的 Myod1和 Myog cDNA 的序列长度及碱基顺序均与所公布的序列相同。将该载体转染到体外培养的3T3细胞内， Western blot能够检测到3T3细胞中Myod1和Myog蛋白的条带。结果证实，实验成功构建了重组Myod1和Myog真核共表达载体pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP。 -
FUS1和IL-12双基因真核共表达质粒的构建及对A549细胞促凋亡作用研究
目的 构建FUS1和人IL-12双基因真核共表达质粒并在肺癌A549细胞中检测基因表达及诱导细胞凋亡作用.方法 采用RT-PCR技术从人肺成纤维细胞MRC-5中逆转录扩增全长FUS1基因,通过PCR技术从pORF-hIL-12质粒中扩增含双亚基的全长IL-12基因.FUS1和IL-12分别经酶切后定向插入真核细胞双顺反子载体pVITRO2的多克隆位点中,酶切和测序鉴定双基因共表达质粒pVITRO2-FUS1-IL-12的构建.以pVITRO2-FUS1-IL-12转染肺癌A549细胞,通过RT-PCR、ELISA 和Western blot方法 检测目的 基因的表达,以Hoechst33258染色及流式细胞术验证pVITRO2-FUS1-IL-12在体外的促凋亡作用.结果 酶切和测序分析表明成功构建了双基因真核共表达质粒 pVITRO2-FUS1-IL-12,在转染后的细胞中同时检测到了FUS1和IL-12的表达,两种基因在双基因表达载体上的表达量基本不受影响.双基因共表达质粒pVITRO2-FUS1-IL-12具有明显诱导肺癌细胞凋亡的作用.结论 成功构建pVITRO2-FUS1-IL-12双基因真核共表达质粒,为肺癌的多基因联合治疗提供了又一新的思路和方法.
