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动物源Ⅰ型胶原蛋白可引起BALB/c小鼠细胞免疫反应和组织免疫毒性
背景：天然纯胶原被认为具有较低的免疫原性和较好的生物相容性。目的：体外评估动物源Ⅰ型胶原蛋白的免疫原性。方法：将牛跟腱经免疫原性清除后，提取制成Ⅰ型胶原蛋白，HPLC 测定胶原蛋白纯度，荧光染色定量胶原蛋白中残留DNA。将50只BALB/c小鼠随机均分为5组，分别皮下注射生理盐水(阴性对照)、小牛来源Ⅰ型胶原蛋白标准品(阳性对照)、33.4，66.8，133.4 mg/kg的动物源Ⅰ型胶原蛋白，1次/d，连续注射12 d后，检测注射胶原蛋白后小鼠淋巴细胞的增殖、细胞分型及NK细胞杀伤功能；连续注射3周后，取脾脏、肝脏及肺组织进行病理组织学检查。结果与结论：相比Ⅰ型胶原蛋白标准品，纯化后的牛源性Ⅰ型胶原蛋白纯度可达到99%以上，而残留 DNA低于1 mg/L，远远低于目前常规脱细胞基质中DNA的残留水平50-100μg/g(干质量)。注射12 d后，各组均未发生淋巴细胞增殖、NK细胞杀伤功能及淋巴细胞亚群的比例的变化。注射3周后，66.8，133.4 mg/kg动物源胶原蛋白组小鼠脾小动脉周围淋巴鞘面积明显增厚变大，有可能引发偶发性的肝损伤和肺损伤，而脾小体生发中心面积未发生明显变化。表明连续皮下注射动物源胶原蛋白可引发 BALB/c 小鼠发生较低水平的脾淋巴细胞免疫应答，可能引起偶发性肝、肺损伤。
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荧光染色法检测重组乙型肝炎疫苗中残留DNA含量
目的 采用荧光染色法检测重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)纯化工艺中间产品、原液及半成品中残留DNA含量.方法 采用《中国药典》三部(2010版)附录ⅨB荧光染色法检测重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)纯化工艺主要中间产品[丁基琼脂糖层析收集液(以下简称BA富集液)]、原液及半成品中残留DNA含量,对该方法的准确度、精密性进行验证,并用建立的方法检测10批BA富集液、原液及半成品中残留DNA含量.结果 该方法线性范围1.25～80 ng/ml,r2≥0.999,低检测限为1.25 ng/ml;DNA标准品在BA富集液、疫苗原液及半成品中的平均回收率分别为105.8％、101.4％和108.5％,准确度较好;不同时间点重复测定同一批样品的变异系数(CV)在1.6％～6.56％之间,不同试验间重复测定同一批样品的CV在1.4％～3.6％之间,试验内和试验间精密性较好;10批BA富集液中DNA浓度均较高,经过纯化后,原液中DNA含量明显降低,半成品中除个别批号外,均基本达到低于10 ng/剂的要求.结论 荧光染色法可用于重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)纯化工艺中间产品、原液及半成品中残留DNA含量的常规监测,具有简便、快速、自动化程度高等特点,测定前样品无需进行处理.
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生物制品残留DNA分析技术的研究进展
生物制品中残留DNA可能具有感染性和致癌性,因此生物制品的纯化过程需要验证,尽可能将产品中残留DNA的水平降到低.厂家有必要显示DNA去除过程,并有适当定量分析方法检测残留DNA的含量.当前DNA定量分析所采用的普遍方法是定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction,Q-PCR).此文就残留DNA的感染性、致癌性、免疫原性等潜在风险以及残留DNA分析技术的新进展做一综述.
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重组水蛭素Ⅲ的质量控制标准研究
通过测定重组水蛭素Ⅲ的质粒中目的基因序列、重组水蛭素Ⅲ分子质量、C末端序列以及菌体蛋白和DNA残留量,对重组水蛭素Ⅲ的质量进行研究.结果:重组质粒经Nhe Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切和基因序列测定,表明工程菌所携带的质粒上含有完整的信号肽基因、Nhe Ⅰ酶切位点、水蛭素HV3基因和HindⅢ酶切位点;还原性SDS-PAGE结果表明在14 000 u处有单一条带,为重组水蛭素Ⅲ二聚体;测定样品分子C端序列为E-D-Y-A-D-E-P-I-P-E-F,与重组水蛭素Ⅲ的理论值一致;重组水蛭素Ⅲ样品中的残留菌体蛋白和DNA含量分别是0.02%和每剂量样品中残留DNA含量低于2.8 ng.结论:从基因水平、蛋白水平和杂质的角度证明重组水蛭素Ⅲ产品符合质量控制标准.
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动物源性生物材料残留DNA的定量检测法
动物源性生物材料的残留DNA定量检测是产品脱细胞处理过程是否彻底,以及免疫原性风险是否得到有效控制的重要产品技术指标之一.目前,国际上还没有针对这类材料的残留DNA检测方法.本研究设计了动物源性生物材料的残留DNA定量检测三步法,即固体生物材料的蛋白酶K消化,DNA纯化和荧光染色法DNA测定,在整个实验过程中增加了回收率实验,经过回收率曲线方程校正后得到终检测结果.实验过程中的磁珠法DNA纯化步骤的优化设计保证了较好的回收率,同时满足了准确性和精密度.该实验方法经验证,其检测灵敏度达到6.25 ng/每份样品,回收率样品DNA含量在3.125～100 ng以及25～400 ng范围内线性良好,其回收率曲线R2＞0.99.此方法保证了生物材料中微量或痕量DNA检测的科学性和可信性.
