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miR-302 a在胃癌中表达及其对胃癌细胞凋亡与细胞周期影响
目的：研究微小RNA-302a(miRNA-302a)在胃癌标本中的表达水平与临床病理特征的关系,以及其对胃癌细胞的凋亡和细胞周期调控作用,以探讨将miR-302a用于胃癌生物靶向治疗的可能性。方法采用实时PCR( RT-PCR)方法检测胃癌组织和正常胃黏膜组织中miR-302a的相对表达水平,并分析其与对应患者的临床病理资料的相关性。同时,采用RT-PCR方法检测miR-302a在胃癌细胞株SGC-7901、MGC-803和BGC-823及正常胃黏膜细胞GES-1中的表达情况；选取miR-302a表达水平低者为癌细胞,并转染过表达miR-302a的真核重组质粒pCDNA3．1-miR-302a；转染后,采用流式细胞仪An-nexin V/PI双染法和PI单染法检测miR-302a对细胞凋亡和细胞周期的影响。结果胃癌组织中miR-302a的相对表达水平显著低于癌旁正常胃癌黏膜组织(P<0．05),且其表达与临床分期、病理分级和转移均有密切关系(P<0．05)。同时,在胃癌细胞SGC-7901、MGC-803和BGC-823中miR-302a的相对表达水平显著低于正常细胞GES-1中的表达(P<0．05),且在BGC-823中表达水平低。 pCDNA3．1-miR-302a质粒转染组与空白组和pCDNA3．1质粒转染组比较,miR-302a质粒转染后48 h后细胞凋亡水平显著升高,且G2/M期细胞数显著增高(P<0．05)。结论在胃癌组织和细胞中miR-302a均呈现低水平表达,当miR-302a过表达后,能显著增高胃癌细胞的凋亡水平并使细胞出现G2/M期阻滞,可能成为胃癌治疗的新靶点。
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miR-302a对叶酸缺乏小鼠胚胎干细胞增殖和凋亡的影响
目的：探讨miR‐302a对叶酸缺乏小鼠胚胎干细胞（mESC）增殖和凋亡的影响。方法mESC分为完全培养基组（对照组），无叶酸培养基组（无叶酸组），无叶酸培养基＋miR‐302amimic组（miR‐302a组），通过RT‐PCR进行检测miR‐302a在完全培养基及无叶酸培养基中的表达。构建miR‐302amimic，后转染到无叶酸培养基mESC中，采用MTT法检测miR‐302amimic对mESC活力的影响，AnnexinV‐FITC／PI流式细胞术检测miR‐302amimic对mESC细胞凋亡的影响；流式细胞术检测miR‐302amimic对mESC细胞周期的影响；Westernblot检测及磷脂酰肌醇3羟激酶（PI3K）／蛋白激酶B（Akt）／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路激活情况，以及下游分子细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、p21、p27表达的影响。结果RT‐PCR证实无叶酸组中miR‐302a表达量下降（P＜0．01）。与完全培养基比较，无叶酸培养基中，mESC细胞活力下降，细胞凋亡增加，细胞周期阻滞在G1期，Akt及mTOR磷酸化水平下降，CyclinD1表达下调，p21及p27表达上调，差异均具有统计学意义（P＜0．01）。与无叶酸组比较，miR‐302a组中，mESC细胞活力上升，凋亡下降，G1期缩短，AKT及mTOR磷酸化水平提高，CyclinD1表达上调，p21及p27表达下调，差异均具有统计学意义（P＜0．01）。结论miR‐302a类似物能显著抑制缺乏叶酸mESC凋亡，能促进其增值，与PI3K／AKT／mTOR信号通路有关。
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miR-302a对结直肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性的影响及机制
目的:探究miR-302a对结直肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性的影响及机制.方法:在四株结直肠癌细胞系HT29、HCT8、SW480、SW1463中,通过转染miR-302a mimic构建miR-302a过表达模型,RT-PCR检测过表达效果;CCK-8法检测转染48 h后高表达miR-302a细胞的增殖能力及对奥沙利铂的敏感性;蛋白质印迹法检测转染后P-gp蛋白及Wnt/β-catenin通路相关蛋白MMP-7、c-Jun、c-myc、β-catenin、LEF1的变化.结果:相比正常小肠上皮细胞 HIEC,miR -302a在结直肠癌细胞系 HT29、HCT8、SW480、SW1463中的表达较低.转染mimic后,miR-302a的表达明显上调(P<0.001).增殖实验发现miR-302a的上调并不影响结直肠癌细胞的增殖,而在转染miR-302a的细胞中加入奥沙利铂,miR-302a组HT29、HCT8、SW480和SW1463细胞存活率相比miR-NC组分别降低2.46、1.89、2.39、2.86倍.进一步探究miR-302a增加奥沙利铂敏感性的机制,发现miR-302a可抑制P-gp蛋白的表达,并且抑制Wnt/β-catenin通路相关蛋白MMP-7、c-Jun、c-myc、β-catenin、LEF1的表达.结论:miR-302a可增加结直肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性,其机制可能是通过抑制P-gp的蛋白表达,并抑制Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达而实现.
