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中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP2结构蛋白的基因分析及B细胞抗原表位预测
目的 预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY 株 VP2 蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位.方法 将已感染CSBV LN-QY 株的RNA作为模板,进行RT-PCR扩增该毒株结构蛋白 VP2 基因,再与pMD18-T载体连接,之后转化大肠杆菌DH5α感受态,对经EcoRⅠ和BamH I双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对,获得LN-QY株VP2的核苷酸序列和推导的氨基酸序列,建立VP2结构蛋白的3D模型,在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域、亲水性、表面可能性以及抗原指数等参数.结果 VP2结构蛋白的空间构象比较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于178-184,144-199,211-217氨基酸区段.结论 本研究为CSBV LN-QY 株VP2蛋白表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研制奠定了理论基础.
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中蜂囊状幼虫病毒VP1基因的优化表达及其免疫原性分析
目的 原核表达优化的中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的VP1基因,并分析其免疫原性.方法 根据大肠埃希菌密码子偏爱性对野生型CSBV VP1 (wtVP1)基因进行优化(optiVP1),将基因wtVP1和optiVP1分别克隆至pGEX-6P-1原核表达系统,构建原核表达质粒pGEX-6P-wtVP1和pGEX-6P-optiVP1,分别转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达,并对诱导温度、IPTG终浓度及诱导时间进行优化,诱导蛋白经Western blot鉴定;重组蛋白经GSH-琼脂糖凝胶层析纯化;分别用PBS、纯化的GST标签蛋白、纯化的重组蛋白及CSBV纯化病毒免疫小鼠,经间接ELISA法检验各组小鼠的血清抗体效价.结果 优化后的VP1基因序列降低了密码子影响指数,提高了密码子适应指数;质粒pGEX-6P-wtVP1和pGEX-6P-optiVP1经鉴定证明构建正确;佳诱导表达条件为:IPTG终浓度0.8 mmol/L,30℃,220 r/rin诱导8h;诱导表达蛋白占菌体总蛋白百分比由wtVP1菌株(5.49±0.30)％提高至optiVP1菌株(59.7±0.51)％,纯化后纯度可达0.5 mg/ml;兔抗GST标签抗体及兔抗CSBV血清均与优化后的重组蛋白发生特异性反应;重组蛋白组小鼠二免后可产生较高水平抗体,明显高于PBS组和GST标签蛋白组(P＜0.05).结论 通过密码子优化实现了CSBV结构基因VP1的高效表达,表达蛋白可诱导小鼠机体产生特异性抗体,具有良好的免疫原性,为探讨CSBV感染的分子发病机制和制备抗CSBV病毒的多克隆抗体奠定了基础.
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中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP1蛋白的空间结构与B细胞抗原表位预测
目的 预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP1蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位.方法 以CSBV LN-QY株RNA为模板,RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,对经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对,获得LN-QY株VPl的核苷酸序列和推导的氨基酸序列,建立VPl结构蛋白的3D模型,在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域,亲水性,表面可能性以及抗原指数等参数.结果 VP1结构蛋白的空间构象比较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于47-53,139-145,273-284氨基酸区段.结论 本研究为CSBV LN-QY株VP1蛋白表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研制奠定了理论基础.
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中蜂囊状幼虫病毒VP1基因在杆状病毒表达系统中的表达
目的 利用杆状病毒系统表达中蜂囊状幼虫病毒(chinese sacbroodvirus,CSBV)结构蛋白VP1基因.方法 提取感染CSBV的中蜂囊状幼虫总RNA,RT-PCR法扩增VP1基因,克隆至载体pFastBacI中,构建重组转座质粒pFastBacI-VP1,转化至感受态大肠埃希菌DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-VP1,转染至昆虫细胞sf9中,获得第1代重组杆状病毒,经透射电镜观察杆状病毒粒子；病毒连续传代3次后,RT-PCR鉴定重组杆状病毒,SDS-PAGE检测VP1蛋白的表达情况,Western blot检测表达产物的反应原性.结果 重组杆粒经PCR鉴定构建正确；第1代重组杆状病毒经透射电镜观察,可见杆状病毒粒子；重组杆状病毒以M13通用引物和VP1基因特异引物进行PCR扩增,分别可见3 263和963 bp的片段,大小均与理论值一致；CSBV VP1基因能够在sf9细胞中表达,表达的重组VP1蛋白相对分子质量约3 1 000,可与兔抗CSBV-VP1阳性血清发生特异性反应.结论 成功利用杆状病毒表达系统表达了CSBV VP1基因,为深入研究CSBV的感染机制和蜜蜂的免疫机制以及中蜂囊状幼虫病血清诊断试剂盒的研制奠定了基础.
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中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP3蛋白空间结构及其B细胞抗原表位的预测
目的 预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV )LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位.方法 采用RT-PCR法从感染CSBV的蜜蜂幼虫总RNA中扩增结构蛋白VP3基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒,双酶切鉴定并测序,通过与SBV-KOR、CSBV-UK株VP3基因序列的比对,获得LN-QY株VP3基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列,建立VP3蛋白的3D结构.在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域、亲水性、表面可能性以及抗原指数等参数.结果 VP3结构蛋白的空间构象较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于4个区域:25-50,101-109,112-120,250-268氨基酸区段,其中,可能出现抗原表位的2个区域在100-150和250-300氨基酸区段,应作为抗原表位研究的重点区域.结论 预测了CSBV LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位,为CSBVVP3蛋白单克隆抗体的制备以及表位疫苗的设计奠定了理论基础.
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中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法的建立
目的 建立中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法.方法 参照已发表的中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)基因序列,针对其结构蛋白基因设计1对特异性引物,提取感染CSBV的囊状幼虫RNA,反转录为cDNA,以其为模板,进行PCR扩增,对检测方法进行优化,验证该方法的特异性及敏感性,并对31份临床样品进行检测.结果 所建立的CSBV RT-PCR检测方法特异性和敏感性良好,以含CSBV结构蛋白基因的重组质粒为模板,低可检出10 pg DNA.临床症状诊断和电镜观察均为阴性的22份样品经RT-PCR检测,有2份扩增出目的条带.结论 已建立了中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法,为CSBV检测、流行病学调查及动物模型的建立奠定了基础.
关键词： 中蜂囊状幼虫病毒 反转录聚合酶链式反应 特异性 敏感性
