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肺炎支原体P1蛋白结构基因的克隆与鉴定
目的:在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白结构基因,为实现肺炎支原体P1 蛋白结构基因的大量扩增及表达奠定基础.方法:PCR方法获取肺炎支原体P1蛋白结构基因,并与pUC19载体DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株.X-Gal平板筛选转化子,用PCR方法和限制性核酸内切酶酶切图谱分析方法鉴定重组克隆.结果:PCR和限制性核酸内切酶图谱分析均证实所获重组质粒中含有P1蛋白基因.结论:获得了含有肺炎支原体P1蛋白结构基因的克隆菌株.
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肺炎支原体重组P1蛋白多克隆抗体的制备及纯化
目的 制备肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)重组P1蛋白多克隆抗体,为Mp抗原诊断试剂的制备奠定基础.方法 用Mp重组P1蛋白免疫家兔,ELISA法测定免疫血清抗体效价；硫酸铵沉淀及离子交换层析法纯化抗体；紫外分光光度法测定抗体的浓度；SDS-PAGE分析抗体的纯度；量子点标记纯化抗体,分析抗体的免疫活性；直接免疫荧光法检测抗体的特异性.结果 重组P1蛋白兔免疫血清抗体效价为1:25 600;纯化的抗体浓度为3.689 μg/μl; SDS-PAGE显示相对分子质量58 000的重链条带；用量子点标记纯化的抗体仍保持较高的免疫活性,与其他呼吸道常见病原菌均未发生特异性结合.结论 获得的纯化Mp P1蛋白IgG抗体具有较高的免疫活性和特异性,可用于临床Mp感染的抗原诊断.
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肺炎支原体P1蛋白抗原决定簇在大肠杆菌中的表达与纯化
目的得到肺炎支原体主要粘附蛋白(P1蛋白)的表达蛋白.材料与方法用PCR产物限制性片段长度多肽性(RFLP)分析等方法鉴定实验用肺炎支原体菌株.针对P1蛋白基因设计上、下游引物,进行PCR扩增.对PCR产物进行回收、纯化,克隆入PET-28C(+)表达载体,并转化入宿主菌BL21.对重组质粒进行酶切及PCR鉴定后,IPTG诱导目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并以Ni-Agarose亲和层析柱纯化.结果1)本实验所用菌株为肺炎支原体2型.2)经PCR扩增得到预期含有BamHI和XhoI的533bp的目的片段.3)完成目的基因片段的克隆与表达,得到20kDa左右表达蛋白.经诱导阳性质粒的蛋白表达,得到较大量纯化的目的蛋白. 结论本研究以国际标准株FH为模板,成功获得纯化的近20kDa的P1蛋白片段,其大小与目的片段理论值相符,且此片段在肺炎支原体1型与2型中的基因同源性为98%.为在基因和蛋白水平进一步研究肺炎支原体P1蛋白成分在肺炎支原体粘附和引起机体免疫反应中的作用机制,打下了良好的基础.
