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Cpn0308真核表达载体的构建及对小鼠免疫功能的影响
目的:构建Cpn0308重组质粒pcDNA3.1/His A-Cpn0308,将重组质粒腹腔注射小鼠后观察小鼠免疫反应变化,以期为进一步研究Cpn0308免疫保护性奠定基础.方法:构建pcDNA3.1/His A-Cpn0308,并用菌落PCR、双酶切、序列测定等多种技术确定其正确性;将重组质粒转染HeLa细胞,间接免疫荧光法检测细胞内蛋白表达情况;重组质粒免疫BALB/c小鼠,一定时间后Western blot 检测血清Cpn0308抗体特异性,间接ELISA法检测小鼠血清中Cpn0308 IgG抗体水平、ELISA试剂盒检测血清中细胞因子.结果:pcDNA3.1/His A-Cpn0308重组质粒构建成功且序列正确;重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光,对照组无荧光;重组质粒组血清抗体A450 x±s为0.343±0.024,pcDNA3.1/His A质粒组为0.174±0.018,PBS组为0.156±0.023,WB结果显示重组质粒组小鼠血清稀释800倍后仍有特异性目的条带出现,对照组不出现;重组质粒组小鼠IFN-γ浓度均值为264 ng/L,IL-4浓度均值为22 ng/L,pcDNA3.1/His A质粒组为:IFN-γ 120 ng/L,IL-4 10 ng/L,PBS组为:IFN-γ99 ng/L,IL-4 9 ng/L.重组质粒组IgG抗体水平和细胞因子水平明显升高,与对照组相比有统计学差异.结论:pcDNA3.1/His A-Cpn0308真核表达重组质粒构建成功,且能够在真核细胞中表达目的蛋白;重组质粒对小鼠进行免疫后,提高了小鼠血清IgG抗体水平和细胞因子水平,为进一步研究Cpn DNA疫苗以及研究该蛋白的生物学功能提供实验基础.
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肺炎衣原体Taqman探针实时荧光定量PCR检测法
目的 针对Cpn0308基因建立检测肺炎衣原体的Taqman探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法.方法 根据肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308基因序列设计引物和Taqman探针,建立Taqman FQ-PCR检测体系,对反应体系进行优化,进行灵敏度、特异性、重复性评价;并与商品化肺炎衣原体核酸检测试剂盒检测临床标本进行对比分析.结果 肺炎衣原体TaqmanFQ-PCR方法的引物浓度300 nmol/L,探针浓度200 nmol/L,Mg2+ 4.0 mmol/L为优反应条件;灵敏度为8.36×102copies/μL;该法对常见几种呼吸道病原菌及沙眼衣原体无交叉反应;重复性试验中4个浓度变异系数均小于3％.自建方法与商品化试剂盒对呼吸道感染组、心血管疾病组及正常对照组标本检出率分别为10％vs 10％ (x2 =0.167,P＞0.05),44.44％vs 40.74％(x2 =0,P＞0.05),6.67％ vs3.33％(x2 =0,P＞0.05),各组阳性率间差异无统计学意义;2种方法的总阳性率(16.54％ vs 14.96％)比较差异无统计学意义(x2=0.071,P＞0.05).结论 本研究建立的Taqman探针实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的方法灵敏度好,特异性高,重复性好,可应用于临床肺炎衣原体核酸检测.
