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人源抗HBsAg抗体Fd段和L链高效表达菌株的筛选
目的：选用高效表达载体分别高效表达人源抗HBsAg抗体的Fd段和L链，经包涵体纯化和变性复性使Fd段和L链之间形成二硫键，终制备有活性、高产量的人源抗HBsAg基因工程抗体Fab。方法：用PCR法从可溶性表达重组质粒抗HBsAg Fad Comb3扩增Fd段和L链后分别构建高效表达载体PQE32-Fd和PQE32-L，并分别导入大肠杆菌M15中进行表达，用SDS-PAGE筛选出高效表达克隆。结果：SDS-PAGE筛选的高效表达克隆M15-PQE32-Fd和M15-PQE32-L经IPTG诱导后以包涵体形式表达，其表达量很高。从高效表达克隆重新扩增Fd段和L链后进行测序鉴定发现所得的序列与已报道的抗HBsAg抗体Fab基因吻合率为97％。结论：虽然已有表达可溶性人源抗HBsAg基因工程抗体Fab的报道，但因其表达量低而不能实际应用。筛选出高效表达人源抗HBsAg抗体Fd段和L链的克隆，因为包涵体形式表达需经变性复性，虽然变性复性后其产量会受影响，但因表达量很高，所以还是有很高的实际应用价值。其包涵体变性复性条件仍需进一步探讨。
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人源抗NH-LBP Fab抗体的制备和初步鉴定
目的:构建人源抗脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)Fab抗体的原核表达载体, 并制备高稳定性Fab抗体.方法:用PCR方法, 从可溶性表达抗NH-LBP抗体的重组质粒pComb3H-Fab中扩增出VH链和VL链基因序列, 分别构建表达质粒pET-28a(+)-VH和pET-28a(+)-VL, 并于工程菌BL21(DE3)star中分别表达及TALON柱芯亲和纯化, 将抗体片段VH和VL共同复性, 通过二硫键形成Fab抗体, 再采用ELISA法初步鉴定其与NH-LBP的结合力.结果:扩增出VL链和VH基因片段长约为650 bp和700 bp, 经BL21star表达出相对分子质量(Mr)约为28 000和30 000的目的蛋白, 共同折叠后所获得Fab抗体与NH-LBP具有较高的结合力.结论:成功地制备抗NH-LBP Fab抗体, 为临床抗炎研究提供了条件.
