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神经元表达发育下调基因siRNA表达载体的构建及鉴定
目的:构建针对神经元表达发育下调基因9(Neural precursor cell expressed,developmentally downregulated 9,NEDD9)的小干扰RNA(siRNA)表达载体,研究载体介导的RNAi技术对A549肺腺癌细胞株中NEDD9表达的抑制作用.方法:根据GenBank提供的NEDD9基因(NM_182966)核苷酸序列及siRNA的设计原则,筛选得到159-177 nt、193-211 nt和648-666 nt 3个19 bp片段靶序列,同时随机组合出一条无关序列;分别合成4对带有BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经退火合成互补DNA双链,克隆入载体pRNAT-CMV3.2中构建重组表达载体,转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.用脂质体介导转染入A549肺腺癌细胞株,采用QRT-PCR和Western blot方法检测细胞NEDD9基因mRNA和蛋白表达.结果:PCR筛选得到4个目的片段的阳性克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低A549细胞中NEDD9 mRNA和蛋白水平的表达.结论:成功构建载体介导的NEDD9靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制A549细胞中NEDD9基因的表达.
关键词： 肺腺癌 神经元表达发育下调基因9 RNA干扰 A549 -
NEDD9基因miRNA干扰质粒的构建及鉴定
目的 构建神经元表达发育下调基因9 (NEDD9)特异性微小核糖核酸(miRNA)干扰质粒,检测其在胃癌SGC-7901细胞中的干扰效果.方法 根据GenBank中提供的NEDD9基因序列,设计4种NEDD9靶向干扰序列(MR0112-1、MR0112-2、MR0112-3和MR0112-4)及1种阴性对照干扰序列(MR0112-N),连接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体中,构建重组质粒.重组质粒转染人胃癌细胞株SGC-7901;采用FQPCR和Western blot法检测转染前后SGC-7901细胞中NEDD9mRNA及蛋白的表达.结果 测序表明,4种干扰质粒的干扰序列及读框完全正确.FQ-PCR和Westernblot结果显示,转染MR0112-1、MR0112-2、MR0112-3和MR0112-4质粒后其NEDD9表达较未处理组分别下降88.01％、96.70％、78.55％和81.34％ (P＜0.05),以MR0112-2干扰效果为明显.阴性质粒组NEDD9 mRNA表达与未处理组比较无明显变化(P＞0.05).结论 成功构建了NEDD9干扰质粒,为进一步研究NEDD9基因表达在胃癌增殖、迁移、侵袭过程中的作用提供实验基础.
关键词： 神经元表达发育下调基因9 胃癌 微小核糖核酸
