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不同乳腺癌细胞系中TLR5和NLRC4受体的表达和定位
目的：：探究TLR5和NLRC4受体在不同乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-435中的表达和定位情况,并探讨重组鞭毛素蛋白对乳腺癌细胞TLR5受体的激活情况。方法：利用Real-time PCR法检测MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-435细胞TLR5和NLRC4 mRNA表达水平,用流式细胞仪检测MDA-MB-231、MCF-7细胞TLR5受体的表达和定位。纯化重组鞭毛素蛋白即全长鞭毛素蛋白FliC(同时激活TLR5和NLRC4两条通路)、FliC△90-97(不能激活TLR5通路)、FliC-L3A(不能激活NLRC4通路)、FliC△90-97：L3A(两条通路都不激活)。用1μg/ml重组鞭毛素蛋白刺激MCF-7细胞,12 h后, ELISA法检测IL-8的分泌。结果：MCF-7细胞TLR5 mRNA表达水平高,约是MDA-MB-435细胞的1700倍,MDA-MB-231细胞TLR5表达水平是MDA-MB-435的约200倍。 TLR5在MCF-7细胞浆和胞膜上均有表达,而MDA-MB-231细胞只在胞浆中表达。激活TLR5通路的FliC和FliC-L3A能够刺激MCF-7细胞分泌IL-8,而不激活TLR5通路的FliC△90-97和FliC△90-97：L3A则不能。结论：不同乳腺癌细胞系都表达 TLR5和 NLRC4,但是表达部位和表达水平不同。 MCF-7细胞 TLR5和NLRC4表达高于其他乳腺癌细胞系。乳腺癌细胞系表面的TLR5受体可以被鞭毛素蛋白激活,为进一步探讨TLR5通路的激活在乳腺癌细胞增殖中的作用提供实验基础。
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激活TLR5和NLRC4通路对小鼠先天免疫细胞的影响
目的：探讨用重组鞭毛素蛋白同时或者分别激活C57BL/6小鼠模型TLR5和NLRC4通路对小鼠先天免疫细胞的影响。方法：首先，表达和纯化重组鞭毛素蛋白即全长鞭毛素蛋白FliC（同时激活TLR5和NLRC4两条通路)； FliCΔ90-97（不能激活TLR5通路)；FliC-L3A（不能激活NLRC4通路)；FliCΔ90-97：L3A（两条通路都不激活)。将小鼠分为5组，分别为：PBS组、FliC组、FliC-L3A组、FliCΔ90-97和FliCΔ90-97：L3A组。分别用PBS和10μg重组鞭毛素蛋白腹腔注射C57BL/6小鼠，每组3只。12 h后收集腹腔灌洗液，流式抗体染色检测腹腔灌洗液中的中性粒细胞和NK细胞的比例。同时，取小鼠脾脏制成脾细胞悬液，流式抗体染色检测DC表面共刺激分子CD80和CD86的表达情况及脾细胞中调节性T细胞（ Treg)的比例。结果：激活TLR5（FliC组和FliC-L3A组)和NLRC4通路（FliCΔ90-97组)小鼠的腹腔灌洗液中中性粒细胞和NK细胞的比例都显著高于PBS组和FliCΔ90-97：L3A组（P<0．01)。激活TLR5通路的FliC组和FliC-L3A组的DC表面CD80和CD86表达水平显著高于 PBS 组、FliCΔ90-97和 FliCΔ90-97：L3A 组（P<0．01)。 FliC-L3A 组调节性 T 细胞的比例高于其他组（P<0．05)。结论：激活TLR5和NLRC4通路可以趋化中性粒细胞、NK细胞，两条通路激活对中性粒、NK细胞有相同的趋化能力。鞭毛素蛋白只有激活TLR5通路才可以上调DCs表面共刺激分子CD80和CD86，促进DCs的成熟。
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激活TLR5和NLRC4通路的重组鞭毛素蛋白对不同乳腺癌细胞系增殖的抑制作用
目的:探究激活TLR5和NLRC4通路的重组鞭毛素蛋白对不同乳腺癌细胞系增殖的抑制作用.方法:表达和纯化重组鞭毛素蛋白即全长鞭毛素蛋白FliC(同时激活TLR5和NLRC4两条通路)、FliC△90-97(不能激活TLR5通路)、FliC-L3A(不能激活NLRC4通路)和Flic△90-97:L3A(两条通路都不激活).用不同浓度的重组鞭毛素蛋白刺激MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞,72 h后,利用CCK8法检测其对肿瘤细胞增殖的影响,并计算抑制率.软琼脂形成实验:每孔细胞数为1 000个MCF-7细胞铺于6孔板中,重组鞭毛素蛋白浓度为1μg/ml,培养14 d后,结晶紫染色,显微镜下计数克隆数,计算克隆形成率.结果:四种鞭毛素蛋白在0.1μg/ml的浓度刺激下,对MCF-7细胞的抑制率达到30％,FliC△90-97对MCF-7的抑制作用是剂量依赖的.在lμg/ml时单独激活TLR5的FliC-L3A鞭毛素蛋白的抑制率高于全长的FliC和单独激活NLRC4的FliC△90-97.FliC△90-97:L3A也对MCF-7细胞有抑制作用.四种鞭毛素蛋白对MDA-MB-231细胞在加转染试剂之后才表现出抑制效应.结论:鞭毛素蛋白可以抑制乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖,其机制可能是由于分别激活胞膜和胞内的除TLR5和NLRC4以外的其他通路.
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NLRC4在儿童败血症中的作用研究
目的 检测NLRC4在败血症儿童血液中的表达,并研究NLRC4在细胞因子产生中的重要性,以及脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞中NLRC4表达的信号传导通路,并研究LPS对巨噬细胞中NLRC4表达的影响.方法 1.采用逆转录-定量聚合酶链反应和Western blot分析法,测定败血症组(n=42)和对照组(n=40)儿童NLRC4的mRNA和蛋白质表达水平;2.在体外使用LPS刺激RAW264.7巨噬细胞,并测定NLRC4及细胞因子表达水平,以研究LPS对NLRC4表达的调节作用;3.在LPS诱导下使用NLRC4 siRNA转染RAW264.7细胞,并再次测定NLRC4及细胞因子表达水平,研究NLRC4对产生炎症细胞因子的影响;4.阻断MAPK信号传导通路,测定NLRC4的表达水平.结果 1.与对照组相比,败血症组NLRC4的mRNA及蛋白质表达水平显著增加;2.NLRC4表达水平随着细胞使用含LPS的培养基培养时间的延长及浓度的增高而显著增加;3.在LPS诱导下经NLRC4 siRNA转染后的RAW264.7细胞中,IL-1β和IL-18的产生明显增加;4.阻断MAPK信号传导通路后,NLRC4的表达水平显著降低.结论 NLRC4在败血症儿童血清中的表达增加;Western blot的结果表明在RAW264.7细胞中LPS以时间和剂量依赖性方式诱导NLRC4表达;ELISA结果显示,通过NLRC4 siRNA转染RAW264.7细胞增强了LPS对IL-1β和IL-18产生的作用;LPS诱导NLRC4的表达水平与MAPK信号传导通路有关.
关键词： 败血症 NLRC4 脂多糖(LPS) MAPK信号传导通路 -
沙门菌鞭毛蛋白与其受体相互作用的研究
沙门菌鞭毛蛋白是其鞭毛丝状部组成元件,参与一系列生理及病理过程.鞭毛蛋白通过结合细胞表面TLR5和胞质NLRC4,激活下游信号通路从而激发固有免疫应答和获得性免疫应答.此外,鞭毛蛋白可促进针对外源抗原的获得性免疫应答,因此可作为佐剂用于疫苗研制,而鞭毛蛋白与TLR5和NLRC4的相互作用也被用于研究其佐剂效应机制.
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牙周炎患者自身组织核酸内NLRP3 mRNA表达水平测定
目的:通过对牙周炎患者自身组织核酸内炎性小体复合物NLRP3,NLRC4及其相关基因IL-18,IL-1β,Caspase-1等mRNA表达水平的检测,明确炎性小体NLRP3在牙周炎中具有调控作用.方法:采集翻瓣术中慢性牙周炎患者炎性牙周组织以及正畸患者健康牙拔除术获取的健康牙周组织,提取总RNA逆转录cDNA,-20℃冻存备用.Real-time PCR检测NLRP3、NLRC4、IL-18、IL-1p、Caspase-1 mRNA的表达.结果:与健康组牙周组织相比较,牙周炎患者自身组织核酸内NLRP3、IL-18、IL-Iβ、Caspase-1 mRNA的表达水平明显增高;而NLRC4 mRNA的表达在两组间差异不显著.结论:NLRP3及其相关基因IL-18、IL-1β、Caspase-1 mRNA在牙周炎患者自身组织核酸内的高表达,提示NLRP3在牙周炎的发病机制中具有影响作用.
关键词： 牙周炎患者自身组织细胞核酸 炎性小体复合物 NLRP3 NLRC4
