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实时荧光定量 PCR 检测血清 miR-7方法的建立及临床初步应用
目的：建立 ploy（A）聚合酶加尾的 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 方法检测血清 miR-7，并作临床初步应用。方法用 Trizol 试剂提取血清总 RNA。miR-7 ploy（A）聚合酶加尾逆转录获得 cDNA，进行 SYBR Green I 实时定量 PCR 扩增检测。制作 C．elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线，绝对定量血清中 miR-7的表达水平。结果该方法能定量检测血清 miR-7表达水平，熔解曲线呈单峰，PCR 扩增产物特异，在103 copies／uL 至106 copies／uL 范围内有良好的线性关系（r 2＝0．995），并且检测重复性好。糖尿病患者血清中 miR-7表达水平明显高于健康体检者（P ＜0．05）。结论所建立的 ploy（A）聚合酶加尾 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 方法能敏感、特异地检测血清中 miR-7的表达水平，为下一步临床应用的研究奠定了方法学基础。
关键词： SYBRGreenI实时荧光定量PCR miR-7 糖尿病 -
SYBR Green I实时荧光定量PCR检测乳腺癌患者 血浆miRNA-155的表达
目的:通过建立成熟的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测血浆中miR-155的表达,并探讨miRNAs与乳腺癌的关系.方法:选取符合纳入标准的41例乳腺癌患者作为研究对象、25例乳腺良性疾病(包括乳腺囊性增生病、乳房纤维腺瘤和乳管内乳头状瘤)患者作为良性对照组、38例健康体检者作为健康对照组,采用茎环引物的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测外周血浆中miR-155的含量.结果:SYBR Green I实时荧光定量PCR能特异性检测血浆中miRNA-155的扩增信号,熔解曲线峰值单一,产物特异;乳腺癌患者血清中miRNA-155水平明显高于乳腺良性疾病(P<0.05),而乳腺癌患者手术切除后血清中的miRNA-155水平明显下降(P<0.05).结论:SYBR Green I实时荧光定量PCR法具有灵敏度高、操作简单且成本低廉等特点,利用此法检测miR-155的表达,对乳腺癌的早期诊断和预后判断有很好的应用前景.
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SYBR Green Ⅰ Real time PCR检测胃癌组织中LIN28基因方法的建立
目的 建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR方法,测定LIN28基因在胃癌组织中的表达水平,并进行实验室方法学评价.方法 采用RT-PCR扩增LIN28 基因片段 ,将该片段克隆到质粒载体PMD18-T上, 转化入大肠埃希氏菌(DH5a)中,PCR鉴定后,提取重组质粒,以阳性质粒为模板,建立SYBR-Green I荧光定量PCR标准曲线,以β-actin为内参,运用Rotor-Gene 6000series software做相对定量分析,检测30例胃癌患者的癌组织中LIN28的表达水平.结果 用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,内参β-actin和LIN28标准曲线相关系数分别为0.999 7和0.999 1,其低的检测拷贝数为1,LIN28溶解曲线呈单个特异峰.结论 成功地构建了LIN28的原核表达载体.建立的SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR法特异度、敏感度高,稳定性好,可用于定量测定胃癌组织中LIN28的表达水平.
