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Caspase8及caspase3单核苷酸多态性与晚期非小细胞肺癌铂类化疗敏感性的相关性
目的：探讨caspase8和caspase3单核苷酸多态性与晚期非小细胞肺癌（ NSCLC）铂类化疗敏感性的关系。方法利用PCR-RELP技术进行单核苷酸多态性（ SNP）基因分型检测。对患者近期及远期疗效进行随访。结果 caspase8 rs3769818、rs3834129、caspase3 rs4647693存在SNP。 caspase3 rs4647693 SNP与近期疗效有关，A/A基因型铂类化疗有效率高于 A/G 及 G/G基因型。 caspase8 rs3769818、rs3834129SNP与顺铂近期疗效无显著差异（ P＞0.05）。 rs3769818、rs4647693 SNP 在无进展生存期中均体现出显著差异，且其与疾病的分期共同影响无进展生存期，而rs3834129SNP在无进展生存期中无显著差异。结论 caspase8 rs3769818、caspase3 rs4647693 SNP 可能是晚期 NSCLC 铂类化疗敏感性的潜在预测因子。
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阴道毛滴虫半胱氨酸蛋白酶基因变异分析
目的 研究阴道毛滴虫半胱氨酸蛋白酶(TvCP)基因变异特点,为分子种系发生和遗传进化等提供参考资料.方法 利用PCR扩增TvCP基因,用pBS-T或pET28b载体构建重组质粒,转化大肠埃希菌,筛选阳性克隆,测定目的基因序列.通过以序列相似性为基础的数据库搜索方法检索同源序列,利用Clustal X、DNAstar等软件分析TvCP基因核苷酸和氨基酸序列多态性、遗传变异和进化规律.结果克隆的TvCP2和TvCP3基因与数据库中相应参考序列在核苷酸和氨基酸水平上的相似性均为99%以上.高度保守.克隆的TvCP4基因与TvCP4参考序列在核苷酸和氨基酸水平上的相似性为97.5%以上,属于TvCP4基因家族的两个不同成员.根据阴道毛滴虫基因组数据库信息,经分析表明TvCP4酶前体由305个氨基酸残基组成,共有大小一致的TvCP4同源分子9个和N-末端缺少部分氨基酸残基的同源分子2个.它们之间的氨基酸序列相似性为62.3%～96.7%.TvCP4、TvCP1-3、TvCP12、TvCP25和半胱氨酸蛋白酶65(CP65)之间也有同源性,氨基酸序列相似性约为61%～88.2%.此外,阴道毛滴虫还拥有为数众多的其他组织蛋白酶L样成员.TvCP构成呈高度多样性.序列联配和聚类分析表明TvCP酶活性位点、酶前体结构中ERFNIN样基序和形成二硫键的半胱氨酸残基数目和位置非常保守,进化树分析也表明它们可能由共同的祖先分子通过基因复制和不断突变进化而来.结论 TvCP组成一蛋白酶家族,家族内各成员酶活性位点上残基高度保守,但其他位点上的序列呈现高度多态性;推测TvCP家族各成员可能由一个共同的祖先基因分子进化而来,在保持酶基本功能的同时又赋予多样的功能.
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猬裂头蚴27kD半胱氨酸蛋白酶基因的克隆、表达及生物信息学分析
目的 克隆、表达猬裂头蚴27 kDa半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease,CP)基因,并分析其生物学特性.方法 提取蛇源猬裂头蚴总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增27kDa半胱氨酸蛋白酶(27kDa CP)基因,克隆入pMD-19T载体,测序正确后将27kDa-CP基因亚克隆入表达载体pET-28a(+),构建pET-28a(+)-27kDa-CP重组质粒,转入大肠埃希菌Tran-setta(DE3)中,经IPTG诱导,表达目的蛋白27kDa CP.用镍离子柱亲和层析法纯化目的蛋白.表达产物用SDS-PAGE及Western Blotting进行分析,并运用NCBI和ExPASy等有关的生物信息学分析工具,对27 CP基因及其编码蛋白进行预测和分析.结果 CP基因序列的开放阅读框长为1 011 bp,去除信号肽序列长954 bp,登录到GenBank,获得登录号ANA52569.该基因编码一个含317个氨基酸的蛋白多肽,属于Peptidase_C39_like超家族,理论分子量约35 669.9 Da,等电点5.92.pET-28a(+)-27kDa-CP重组质粒经IPTG诱导后,蛋白在大肠埃希菌中成功表达,经纯化后的蛋白利用Western blotting检测,证明与预期大小相符,且与猬裂头蚴感染阳性血清有较好的结合反应.结论 成功克隆、表达了猬裂头蚴27kDa CP基因,获知CP基因及其编码的氨基酸序列和生物信息学.
