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虫种特异性基因检测小鼠无虫病理组织裂头蚴感染的可行性研究
目的 研究用细胞色素C氧化酶1基因(cox1)及内转录间隔区1(ITS-1)特异性序列检测小鼠无虫病理组织中裂头蚴感染的可行性. 方法 6～8周龄昆明小鼠20只,采用随机抽签法分为感染组(15只)和未感染组(5只),感染组小鼠经口感染蛇源裂头蚴(5条/只),未感染组不作任何处理. 感染后第14天剖杀小鼠,取感染组小鼠皮下含裂头蚴肌肉组织(含虫组织)、去除裂头蚴肌肉组织(无虫组织)及未感染组小鼠相应部位肌肉,制作组织切片,苏木精-伊红染色法(HE)染色后观察. 用改良的蛋白酶K消化法提取未染色肌肉组织切片的DNA,PCR扩增cox1(2对引物,对应cox1-1和cox1-2片段)和ITS-1序列.选取从感染组无虫组织DNA扩增的cox1-1进行克隆并测序,与GenBank 中猬裂头蚴序列(KJ418421、KF990161、GQ999947)进行比对.以猪囊尾蚴感染的小鼠肌肉组织同法制作切片并提取DNA,评价cox1和ITS-1 PCR扩增的特异性. 结果 感染组含虫组织DNA经1次PCR即可扩增出414bp(cox1-1)、151 bp(cox1-2)、822 bp(ITS-1)的条带.感染组无虫组织DNA笫1次PCR未扩增出条带,以第1次PCR产物为模板再次PCR,扩增出相同大小的3条条带.未感染组DNA第1次和第2次PCR均未扩增出条带.序列比对结果显示,从感染组无虫组织DNA扩增的cox1-1序列与KJ418421、KF990161、GQ999947序列的同源性分别为98.2％、99.1％、99.1％.猪囊尾蚴感染组织DNA没有扩增出条带. 结论 以cox1和ITS-1序列为靶序列进行重复PCR,能鉴定小鼠无虫病理组织裂头蚴感染.
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猬迭宫绦虫裂头蚴感染小鼠皮下肌肉组织β1转化生长因子含量变化的观察
目的 探讨β1转化生长因子(TGF-β1)在猬迭宫绦虫(Spirometra erinacei)裂头蚴感染小鼠皮下肌肉组中的表达情况及意义.方法 对采自野生王锦蛇(Elaphe carinata)的裂头蚴进行形态学观察和PCR检测.昆明小鼠80只,用数字随机表法挑选40只,雌雄各半作为实验组,剩余40只为对照组.用蛇源裂头蚴经口喂饲实验组小鼠,5条/鼠.于喂饲后第7、14、28、56天各随机剖杀10只,分别收集含有裂头蚴寄生的皮下肌肉组织,用中性甲醛固定,制作石蜡切片.HE染色后,观察裂头蚴感染病灶周围的病理变化和纤维化程度;免疫组化检测皮下肌肉中TGF-β1的含量变化.对照组不喂饲裂头蚴,检测时间及方法同实验组.结果 PCR扩增获得约400 bp的目的条带.测序结果显示,该裂头蚴COX1基因与GenBank中的猬迭宫绦虫序列一致性为99.12％.HE染色检查,皮下肌肉中的裂头蚴被炎性囊壁所包裹,虫体与囊壁之间形成穴腔,穴腔有时出现少许的浆液或血液.囊壁里面的区域有薄层的纤维蛋白、坏死的碎片,壁中早期以中性粒细胞浸润为主,也有嗜酸粒细胞、巨噬细胞、浆细胞等,随着病程的进展,炎性囊壁逐渐扩大,壁中以慢性炎性细胞浸润为主,囊壁周围是宿主的组织细胞,纤维结缔组织增生明显,并有不同程度的纤维化.免疫组化检查结果显示,TGF-β1的主要表达部位为裂头蚴周围的炎症反应带和纤维结缔组织增生部位.TGF-β1相对表达量在感染后逐渐增高,于感染第28天达峰值(0.6545±0.0455),第56天时明显下降.在感染后第7～56天,实验组的TGF-β1水平为(0.5026±0.0082)～(0.3468±0.0304)与同期对照组的(0.2700±0.0016)～(0.2740±0.0051)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 小鼠感染猬迭官绦虫裂头蚴早、中期,TGF-β1表达水平均提高,其免疫抑制作用不利于清除和控制皮下肌肉组织中的裂头蚴.
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mRNA差异显示技术分离猬迭宫绦虫幼虫特异表达基因
目的查找猬迭宫绦虫幼虫-裂头蚴阶段特异性表达基因.方法裂头蚴和成虫组织用异硫氢酸胍-步法提取总RNA,用DNA酶去除总RNA中污染的DNA.使用T12MA、T12MC、T12MG和T12MT 4种锚定引物反转录合成cDNA,再用1种随机引物与上述4种锚定引物在含同位素的反应液中进行PCR反应.将PCR产物用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,经放射自显影后,从凝胶上选出裂头蚴与成虫不同的差异带,PCR扩增后经杂交试验鉴定出不同种类的基因片段;以筛选出的差异带作探针,分别与裂头蚴和成虫RNA进行Northern杂交证实裂头蚴阶段表达基因;将差异带测序后与GenBank中的序列进行同源性比较.结果从凝胶中共选出11条差异带.将回收的11条带再经PCR扩增和杂交试验,从中选出3种不同的基因片段.经Northern杂交证实片段1和片段2为裂头蚴特异表达基因,而片段3为裂头蚴和成虫共同表达的基因.3个基因片段测序后与GenBank中的基因进行同源性分析,基因片断1和2无同源序列;基因片段3与多种生物的28S rRNA同源.结论通过mRNA差异显示技术查找出2个裂头蚴阶段特异性表达基因片段.
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ELISA法检测猬迭宫绦虫抗体的研究
目的探讨研制猬迭宫绦虫特异性诊断方法.方法将已克隆的编码猬迭宫绦虫幼虫半胱氨酸酶的基因重组到表达载体内,制备高纯度的基因工程抗原,以此基因工程抗原制成酶联免疫吸附试剂盒,检测6例裂头蚴病患者血清.结果与结论基因工程抗原能与裂头蚴病患者血清发生很强的特异性反应,而不能与囊虫病患者血清发生反应.此方法的建立为裂头蚴病的特异性诊断奠定了基础.
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猬裂头蚴27kD半胱氨酸蛋白酶基因的克隆、表达及生物信息学分析
目的 克隆、表达猬裂头蚴27 kDa半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease,CP)基因,并分析其生物学特性.方法 提取蛇源猬裂头蚴总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增27kDa半胱氨酸蛋白酶(27kDa CP)基因,克隆入pMD-19T载体,测序正确后将27kDa-CP基因亚克隆入表达载体pET-28a(+),构建pET-28a(+)-27kDa-CP重组质粒,转入大肠埃希菌Tran-setta(DE3)中,经IPTG诱导,表达目的蛋白27kDa CP.用镍离子柱亲和层析法纯化目的蛋白.表达产物用SDS-PAGE及Western Blotting进行分析,并运用NCBI和ExPASy等有关的生物信息学分析工具,对27 CP基因及其编码蛋白进行预测和分析.结果 CP基因序列的开放阅读框长为1 011 bp,去除信号肽序列长954 bp,登录到GenBank,获得登录号ANA52569.该基因编码一个含317个氨基酸的蛋白多肽,属于Peptidase_C39_like超家族,理论分子量约35 669.9 Da,等电点5.92.pET-28a(+)-27kDa-CP重组质粒经IPTG诱导后,蛋白在大肠埃希菌中成功表达,经纯化后的蛋白利用Western blotting检测,证明与预期大小相符,且与猬裂头蚴感染阳性血清有较好的结合反应.结论 成功克隆、表达了猬裂头蚴27kDa CP基因,获知CP基因及其编码的氨基酸序列和生物信息学.
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虫种特异性基因检测小鼠无虫病理组织裂头蚴感染的可行性研究
目的 研究用细胞色素C氧化酶1基因(cox1)及内转录间隔区1(ITS-1)特异性序列检测小鼠无虫病理组织中裂头蚴感染的可行性. 方法 6～8周龄昆明小鼠20只,采用随机抽签法分为感染组(15只)和未感染组(5只),感染组小鼠经口感染蛇源裂头蚴(5条/只),未感染组不作任何处理.感染后第14天剖杀小鼠,取感染组小鼠皮下含裂头蚴肌肉组织(含虫组织)、去除裂头蚴肌肉组织(无虫组织)及未感染组小鼠相应部位肌肉,制作组织切片,苏木精-伊红染色法(HE)染色后观察.用改良的蛋白酶K消化法提取未染色肌肉组织切片的DNA,PCR扩增cox1(2对引物,对应cox1-1和cox1-2片段)和ITS-1序列.选取从感染组无虫组织DNA扩增的cox1-1进行克隆并测序,与GenBank中猬裂头蚴序列(KJ418421、KF990161、GQ999947)进行比对.以猪囊尾蚴感染的小鼠肌肉组织同法制作切片并提取DNA,评价cox1和ITS-1 PCR扩增的特异性. 结果 感染组含虫组织DNA经1次PCR即可扩增出414 bp(cox1-1)、151 bp (cox1-2)、822 bp(ITS-1)的条带.感染组无虫组织DNA第1次PCR未扩增出条带,以第1次PCR产物为模板再次PCR,扩增出相同大小的3条条带.未感染组DNA第1次和第2次PCR均未扩增出条带.序列比对结果显示,从感染组无虫组织DNA扩增的cox1-1序列与KJ418421、KF990161、GQ999947序列的同源性分别为98.2％、99.1％、99.1％.猪囊尾蚴感染组织DNA没有扩增出条带. 结论 以cox1和ITS-1序列为靶序列进行重复PCR,能鉴定小鼠无虫病理组织裂头蚴感染.
