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人呼吸道合胞病毒F1蛋白的原核表达及纯化
目的 克隆A型人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州分离株F1基因,并进行原核表达和纯化.方法 采用RT-PCR方法克隆RSV F1 ORF序列,克隆至pET-42b(+)表达载体,构建重组原核表达质粒pET-42b-Fl,转化大肠杆菌Rossata(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经 SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用GST亲和层析树脂进行纯化.结果 重组原核表达质粒经双酶切及测序证明构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约77000,表达量约占菌体总蛋白的20%,以包涵体和可溶性两种形式存在;该蛋自可与鼠抗人RSV单抗发生特异性反应,纯化后纯度约为50%.结论 已原核表达并纯化了HRSV Fl蛋白,为其血清抗体的制备及免疫原性研究奠定了基础.
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鼠疫耶尔森氏菌环介导等温扩增检测方法的建立
目的:将环介导等温扩增技术(LAMP)应用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测.方法:针对鼠疫耶尔森氏菌F1基因设计特异性引物,进行LAMP扩增.应用LAMP技术对鼠疫菌和非鼠疫菌进行检测以确定其特异性；对倍比稀释鼠疫菌液进行检测以确定其灵敏度,并与常规PCR方法进行比较.结果:对10种非鼠疫菌进行LAMP扩增,均为阴性结果,证明该方法具有很高的特异性.LAMP方法低检出量为20个鼠疫菌,比常规PCR方法的灵敏度高10倍.通过加入染料进行LAMP扩增可直接观察结果.结论:本方法检测鼠疫耶尔森氏菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、结果易于判定,有望发展成为快速检测鼠疫耶尔森氏菌的有效手段.
关键词： 鼠疫耶尔森氏菌 环介导等温扩增技术(LAMP) F1基因 检测 -
鼠疫F1-V融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达及鉴定
目的通过构建pET-11c-F1-V融合表达质粒,从而获得具有免疫原性的融合蛋白.方法克隆鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)的V基因和V基因,然后将F1基因和V基因分别连接到pGEM-T载体上,经测序正确后再将F1基因和V基因连接到pET-11c原核表达载体上,构建pET-11c-F1-V融合表达质粒,并转化到BL21(DE3)大肠杆菌中,进行PCR及双酶切鉴定,筛选阳性克隆,通过IPTG诱导F1-V表达,经SDS-PAGE检测表达产物,通过Western-Blot检测重组蛋白的免疫原性.结果测序结果显示F1基因的碱基序列与Gene-bank(X 61996)完全一致,V基因的碱基序列与Gene-bank(M 26405)相比在564 bp处有一同义突变;SDS-PAGE在Mr约58 000处出现一条蛋白条带,经薄层扫描分析目的蛋白条带约占全菌体蛋白的25%左右,主要以可溶性蛋白形式存在;Western-Blot显示重组蛋白具有免疫原性.结论成功地构建了pET-11c-F1-V融合表达质粒,并且在大肠杆菌中获得了高效表达,表达的蛋白具有免疫原性.
