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乳糖诱导重组人睫状神经营养因子在大肠杆菌中的可溶性表达
目的 利用乳糖替代IPTG,诱导重组人睫状神经营养因子(Recombinant human ciliary neurotrophic factor,rhCNTF)在原核工程菌BL-TCS中可溶性表达,并选择适的诱导表达条件.方法 在不同的温度下,利用不同浓度的乳糖及0.5 mmol/L的IPTG,诱导含有人CNTF基因的工程菌9 h,比较菌体生长、乳糖消耗以及目标蛋白的表达规律.结果 乳糖组的菌体A600值均高于IPTG组.乳糖诱导产生的rhCNTF主要以可溶形式表达,各浓度乳糖的诱导效果均能接近或超过IPTG的效果.以2%乳糖在25℃下诱导6 h,可以达到比较好的诱导效果.结论 乳糖可取代IPTG诱导人CNTF基因表达,并获得良好效果.
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人睫状神经营养因子基因克隆、表达、纯化及其生物活性
目的克隆人睫状神经营养因子(hCNTF)基因,在大肠杆菌宿主系统中高效表达并纯化,获得具有生物活性的hCNTF蛋白.方法以人染色体DNA为模板,经PCR扩增到编码CNTF成熟蛋白的cDNA序列,并克隆进原核表达载体pBV220,在大肠杆菌BL21(Gold)中进行表达,产物经CM-Sepharose FF柱纯化后,以体外培养的鸡胚背根神经节(DRG)测定生物活性.结果重组表达质粒pBV220-CNTF在大肠杆菌BL21(Gold)中获得了非融合的稳定、高效表达,目的蛋白占细胞总蛋白的45%左右,以可溶性和包涵体两种形式存在,表达上清及包涵体复性后经CM柱一步纯化纯度达90%以上;表达的重组hCNTF能促进培养的鸡胚背根神经节神经突起的生长.结论基因工程rhCNTF的获得为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定基础.
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人睫状神经营养因子基因的克隆、表达、纯化和生物活性鉴定
目的表达和纯化人睫状神经营养因子(CNTF)并观察其生物学活性.方法用PCR方法构建人CNTF的结构基因,并克隆于pLy4原核表达载体中.将重组表达质粒pLy4-CNTF转化大肠埃希菌JF1125,30℃培养至A600(nm)达到0.6时,迅速升温至42℃诱导目的蛋白的表达.细菌经超声破胞,包涵体经变性、复性、透析和阴离子交换层析,获得纯化的CNTE重组蛋白.然后,用鸡胚背根神经节神经元细胞存活实验观察其生物活性.结果42℃诱导后可以获得Mr≈22.9×103的目的蛋白,Westem印迹结果进一步表明,其具有人CNTF的抗原性.表达蛋白主要以不溶形式存在,占菌体蛋白的35%以上,表达产物经变性、复性,纯化后可获得纯度90%以上的目的蛋白.该重组蛋白能够促进鸡胚背根神经节神经元细胞的存活.结论在大肠埃希菌JF1125中成功表达了人CNTF分子,经变性、复性,纯化后得到具有生物活性的蛋白.
