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小鼠脱氧核糖核酸酶Ⅱα融合基因的原核表达及多克隆抗体的制备
目的 原核表达LHRH-TAT-DNaseⅡα融合基因(LTD),并制备多克隆抗体.方法 采用PCR法克隆LTD基因片段,插入pET-28a载体,构建重组原核表达质粒pET-28a-LTD,转化大肠埃希菌BL21 (Rossetta),经IPTG诱导表达.融合蛋白经电洗脱分离纯化后,免疫獭兔,制备LTD蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗血清效价.结果 构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;纯化得到的融合蛋白相对分子质量为39 270,浓度为0.5 mg/ml,可被兔抗LTD抗体识别.血清抗体效价可达1∶6 400.结论 成功原核表达了DNaseⅡ融合蛋白LTD,并制备了多克隆抗体,为进一步研究DNaseⅡ蛋白体内外抗肿瘤活性及作用机制奠定了基础.
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旋毛虫肌幼虫p43cDNA的克隆及鉴定
目的克隆旋毛虫肌幼虫p43cDNA并对其表达的融合蛋白酶活性进行鉴定与分析.方法用PCR技术从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因,克隆到pMD-18T载体,转化至大肠埃希菌NovaBlue,序列测定后克隆到原核表达载体pET28a并转入表达菌DE3中.经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后提取包涵体并复性,通过降解双链λDNA测定其融合蛋白脱氧核糖核酸酶Ⅱ(DNase Ⅱ)活性.结果成功克隆到p43 cDNA序列,该cDNA序列与美国发表的存在两个核苷酸的变异,分别为第210位的C变为T,第604位的A变为G.基于3名研究者从旋毛虫T.spiralis美国分离株获得的序列相同、6名国内研究者(含本课题组)从T.spiralis中周分离株获得的序列也相同,由此可以确定这两个核苷酸的变异为T.spiralis中国分离株特异性和特征性单核苷酸多态性(SNP)标记.p43重组蛋白能够降解双链λDNA,表明其有DNase Ⅱ酶活性.结论成功克隆到p43cDNA,T.spiralis中国分离株的p43cDNA具有两个SNP标记,其表达的重组蛋白具有DNase Ⅱ酶活性.
