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重组人成纤维细胞生长因子21慢病毒质粒的构建及鉴定
目的 构建人成纤维细胞生长因子21(human fibroblast growth factor 21,hFGF21)重组慢病毒质粒,并进行包装和鉴定.方法 PCR扩增人FGF21 ORF序列,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后,连接至慢病毒载体PLV-EF1 a-EGFP[2A] Puro,构建重组慢病毒质粒PLV-EF1 a-EGFP[2A]Puro-hFGF21,经293T细胞包装为重组慢病毒颗粒,并感染KMB17靶细胞.荧光显微镜观察293T细胞中报告基因EGFP的绿色荧光,判断重组慢病毒的感染效率;RT-PCR法检测KMB17靶细胞中hFGF21基因mRNA的转录;免疫荧光和Western blot法检测KMB17靶细胞中hFGF21蛋白的表达.结果 重组慢病毒质粒PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro-hFGF21经双酶切及测序鉴定,证明构建正确,在包装细胞中获得较高的转染效率,重组慢病毒感染KMB17靶细胞72 h后,荧光显微镜下可见EGFP绿色荧光.感染组KMB17靶细胞中存在hFGF21基因mRNA的转录和蛋白的表达.结论 成功构建了重组慢病毒质粒PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro-hFGF21,并于KMB17靶细胞中表达,为FGF21功能与特性的相关研究及基因工程药物的探索和研发奠定了基础.
关键词： 人成纤维细胞生长因子21 慢病毒质粒 KMB17细胞 -
ALDH2 shRNA质粒构建及其对酒精致HepG2细胞毒性的影响
目的 构建抑制人乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因表达的shALDH2-PLKO.1重组慢病毒质粒,并将重组质粒转染HepG2细胞株,为构建ALDH2基因沉默细胞株及研究ALDH2在酒精致HepG2细胞毒性中的作用奠定基础.方法 设计3对ALDH2 shRNA序列并插入到PLKO.1-GFP载体中,通过测序鉴定.将ALDH2 shRNA和包装质粒共转染293FT细胞,收集24、48和72 h病毒液进行浓缩,通过梯度稀释法测定病毒液滴度.Western blot和qRT-PCR检测转染shRNA的HepG2细胞ALDH2蛋白和mRNA表达量.MTS比色法检测转染shRNA的HepG2细胞在酒精染毒后的增殖能力.结果 测序结果显示shALDH2-PLKO.1质粒构建成功;滴度测定结果显示包装系统成功包装出病毒颗粒,病毒滴度为:4× 107 TU/ml;Western blot及qRT-PCR结果显示,与对照组比较,转染了shALDH2-1和shALDH2-3的HepG2细胞蛋白和mRNA表达量明显下调,其中shALDH2-1组抑制率为51％ (P=0.046),shALDH2-3组抑制率为72％ (P=0.008),差异有统计学意义;MTS结果显示转染shRNA的HepG2细胞株酒精染毒后细胞增殖能力明显下降.结论 成功构建了靶向ALDH2基因的重组慢病毒表达质粒,而且shALDH2-PLKO.1可以有效抑制HePG2细胞中ALDH2基因的表达,为研究ALDH2基因在酒精性肝病和肝癌中的作用机制奠定了基础.
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GPC6基因RNA干扰病毒载体的构建及在鼻咽癌传代细胞株中的表达
目的 构建磷脂酰基醇蛋白聚糖-6(glypican-6,GPC6)的RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体,转染人鼻咽癌细胞株CNE-2Z细胞,鉴定沉默效应.方法 设计GPC6基因特异性RNA干扰靶序列,与经A-gel和EcorI酶切后的GV115载体连接,产生重组慢病毒质粒GV115,筛选阳性克隆,测序鉴定,与慢病毒包装载体共转染293T细胞,荧光/绝对定量(qPCR)法测定滴度.慢病毒感染鼻咽癌细胞株CNE-2Z细胞,RT-PCR检测靶基因的沉默效率.结果 双酶切鉴定GPC6基因干扰病毒载体,证实短发夹RNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入序列正确,293T细胞包装慢病毒后,其GPC6基因慢病毒载体的病毒滴度为2.0×108 TU/mL,干扰效率为80％.shRNA干扰鼻咽癌CNE-2Z细胞GPC6基因后,RT-PCR、结果显示感染后GPC6基因的mRNA水平显著下降,证明重组慢病毒对CNE-2Z细胞中GPC6基因有明显敲减作用.结论 成功构建针对鼻咽癌细胞株CNE-2Z细胞株的GPC6基因RNA干扰慢病毒载体,并获得GPC6基因稳定干扰的鼻咽癌细胞株,为进一步研究GPC6基因在鼻咽癌发生过程中的作用奠定基础.
