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旋毛虫Serpin基因的体外表达及其特性鉴定
目的 体外表达旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serpn)基因,并检测其在旋毛虫不同发育时期mRNA转录、蛋白表达与分子定位及反应原性情况,为以其作为候选诊断抗原基因提供实验依据.方法 根据旋毛虫Serpin基因序列,以重组质粒pBlue-script-WM5为模板,利用PCR技术去除其全长cDNA的信号肽序列,采用原核表达载体pET-28a构建不含该基因信号肽的、融合蛋白不含组氨酸标签的重组表达质粒pET-28a-WM5.转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物纯化后,采用Western blot法检测反应原性.免疫组织化学技术检测Serpin蛋白在旋毛虫不同发育时期的表达及定位情况.采用RT-PCR和实时定量RT-PCR技术检测Serpin基因在旋毛虫不同发育时期的转录水平.结果 重组质粒pET-28a-WM5经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确,Serpin基因能够在大肠杆菌中高效表达.重组蛋白主要以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的51.1%.纯化后的重组蛋白纯度可达98%.与猪抗旋毛虫60 d抗血清有较好的反应原性,与26 d猪抗血清无明显反应信号;RT-PCR与实时定量RT-PCR结果显示,该基因在旋毛虫不同发育时期均有转录,但转录水平有明显差异,有2个转录高峰期(Ad2/Ad3和ML)以及1个转录水平明显下降期(Ad5);免疫组化鉴定表明,Serpin天然抗原在旋毛虫肌幼虫时期18 d开始表达,且在感染35 d后大量表达和分泌.结论 已获得较高纯度的旋毛虫Serpin体外表达融合蛋白,其具有较好的反应原性.旋毛虫Serpin基因具有期特异性表达的特点,且在肌幼虫期具有高转录与高表达水平,可作为捕获旋毛虫肌幼虫期循环抗体的候选诊断抗原基因.
